Tabel VIII. Nilai D
Kadar ng
Kadar yang ditemukan
ng D
0,053 0,044
15,568 0,105
0,102 2,757
0,158 0,172
9,216 0,210
0,212 0,808
0,263 0,257
2,461 0,368
0,374 1,532
0,526 0,521
0,896 0,789
0,801 1,495
1,052 1,071
1,788 Rata-rata
1,497 SD
0,608 RSD
0,407
Berdasarkan pada tabel VI di atas, nilai D difenokonazol masuk kriteria persyaratan yaitu D 20 .
Kesimpulan : Berdasarkan pada nilai presisi, akurasi, kisaran dan linearitas kurva baku serta IDL dan IQL yang dicapai, GC-ECD dapat
digunakan dalam penetapan kadar residu fungisida difenokonazol.
B. Preparasi Sampel dengan Metode QuEChERS
Preparasi sampel merupakan tahapan penting dalam suatu analisis. Optimasi pada tahapan preparasi sampel perlu dilakukan dengan tujuan mendapatkan hasil
optimal. Pada penelitian ini optimasi dilakukan terhadap cara kerja preparasi matriks
sampel melon dengan metode modifikasi QuEChERS dan optimasi fase diam SPE C
18
. 1.
Optimasi ekstraksi matriks buah melon
a. Pengecekan kadar air dalam buah melon
Suatu sampel yang digunakan dalam suatu penelitian harus memiliki kesempatan yang sama untuk dijadikan sampel, sehingga sampling dilakukan
secara acak. Sampel yang dimaksud dalam penelitian ini adalah buah melon dari beberapa pasar di Yogyakarta. Sampling analytical portion untuk buah
melon dilakukan dengan metode kuartering dan dihomogenkan dengan blender.
Tujuan dari pengecekan kadar air dalam buah melon adalah untuk menentukan perlu atau tidaknya tambahan air dalam proses homogenisasi
sampel dengan blender. Proses preparasi sampel dengan metode QuEChERS mempersyaratkan bahwa kadar air harus 80 tidak diperlukan tambahan air
Anastasiades. Pada penelitian ini kadar air yang terkandung dalam buah melon sangat tinggi yaitu lebih dari 90 sehingga tidak perlu adanya
penambahan air dalam homogenisasi sampel.
Tabel IX. Kadar air dalam buah melon
Awal gram Berat akhir setelah oven gram
Selisih R1
10,068 0,402
9,666 R2
10,007 0,845
9,162 Rata-rata
9,378 kadar air
93,78
1 Ekstraksi dan clean-up dengan metode modifikasi QUECHERS
Metode yang digunakan untuk preparasi sampel pada penelitian ini adalah metode QuEChERS yaitu ekstraksi dengan pelarut asetonitril dan
campuran garam QuEChERS, clean-up dengan SPE yang didispersikan ke dalam ekstrak dan dideterminasi.
Pada metode QuEChERS, garam-garam yang digunakan adalah Magnesium sulfat, Natrium Klorida, Natrium Sitrat dan disodium sitrat
hydrogenate sesquihydrate. Masing-masing garam memiliki kegunaan yang berbeda, magnesium sulfat anhidrat berfungsi untuk menarik air,
natrium klorida berfungsi sebagai agen salting out effect, sedangkan natrium sitrat dan disodium sitrat hydrogenate seshydrate ditambahkan
untuk mengontrol pH antara 4-6 Leung phenoomenex,2012-UCT. pH sampel dijaga antara 4-6, hal ini dkarenakan pada kisaran pH
4-6 jumlah koekstraktan dalam hasil ekstraksi lebih sedikit dibandingkan dengan jumlah koekstraktan pada raw material.
Sampel yang telah ditambahkan garam dalam tabung sentrifuge ditambahkan pelarut asetonitril kemudian di gojog dan di vortex.
Penggojogan bertujuan untuk memecah gumpalan matriks sampel untuk memperoleh luas permukaan yang besar sehingga kesetimbangan yang
optimum akan lebih mudah tercapai.
Sampel memiliki partikel dengan ukuran dan berat jenis yang bebeda-beda, untuk memisahkan senyawa yang memiliki ukuran dan
berat jenis yang berbeda dilakukan sentrifugasi. Optimasi sentrifugasi perlu dilakukan untuk mendapatkan waktu dan kecepatan sentrifugasi
yang optimum.Pada penelitian ini optimasi sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 5000 rpm selama 5, 10.Dan 15 menit. Hasil akhir menunjukan
bahwa selisih supernatan yang terbentuk dari 3 waktu yang berbeda diatas tidak berbeda signifikan, sehingga waktu yang paling singkat yaitu 5
menit yang digunakan untuk preparasi sampel selanjutnya.
Tabel X. Hasil optimasi lama sentrifugasi
Waktu sentrifugasi dalam 5000 rpm menit
Jumlah supernatant mL
5 4,0
10 4,0
15 4,2
Ada 3 lapisan yang terbentuk setelah sampel disentrifugasi, berdasarkan berat jenisnya asetonitril 0,789 gcm
3
berada pada lapisan yang paling atas sedangkan air 1 gcm
3
berada di lapisan bawah. Difenokonazol memiliki kelarutan yang cukup tinggi dalam air
yaitu 15 mgL sehingga untuk mengurangi kelarutannya dalam air sampel ditambahkan garam NaCl yang berfungsi untuk memberikan
salting out effect. Lapisan asetinitrik diambil untuk di analisis selanjutnya. Pada penelitian ini dilakukan reekstraksi sampel untuk
mengantisipasi tertinggalnya analit difenokonazol karena masih tertahan
di dalam
matriks sampel.
Reekstraksi bertujuan
memaksimalkan ekstraksi analit, sehingga recovery yang diperoleh lebih baik. Total supernatan yang diperoleh dari 5 gram sampel
tersebut dikeringkan dengan nitrogen untuk kemudian di clean-up dengan SPE C
18
dan dideterminasi dengan GC-ECD. a.
Optimasi Clean-up dengan SPE C
18
Melon merupakan matriks yang kompleks, sebagian besar kandungan melon bersifat polar salah satu contohnya vitamin C
dan karbohidrat. Senyawa yang menjadi analit target pada penelitian ini adalah difenokonazol. Clean-up menjadi salah satu
tahapan penting untuk meminimalisir kandungan matriks yang mengganggu analit target. Clean-up merupakan praperlakuan
sampel yang bertujuan untuk memisahkan analit dari komponen- komponen matriks yang mungkin menggangu pada saat
pengukuran atau deteksi analit. Clean-up dalam penelitian ini menggunakan SPE C
18
sistem fase terbalik. Clean-up dengan metode Solid Phase Extraction SPE praktis dan hemat pelarut
Watson,1999. Strategi yang digunakan dalam penelitian ini diharapkan fase gerak atau pelarut mampu menahan semua residu
analit difenokonazol dalam sebuah SPE C
18
dengan ikatan lemah sehingga analit dapat terelusi. Senyawa-senyawa yang cenderung
lebih polar akan ikut terelusi dengan fase gerak. Akuabides digunakan sebagai fase gerak saat washing sedangkan metanol
digunakan sebagai fase gerak saat elusi. Berdasarkan pada sifat fisika-kimia, difenokonazol memiliki kelarutan sebesar 15 mgL
di dalam air sedangkan dalam metanol sebesar 500 gL, yang berarti kelarutannya lebih tinggi dalam metanol.
Optimasi clean-up yang dilakukan dalam penelitian ini adalah optimasi penentuan kapasitas SPE C
18
, washing dan elusi SPE C
18
. a
Penentuan kapasitas SPE C
18
Penentuan kapasitas SPE C
18
yang akan digunakan dalam penelitian dilakukan dengan menimbang berat
ekstrak untuk setiap 1 ml. Hasil penimbangan tersebut didapatkan bahwa 1 ml sampel yang telah dikeringkan
dalam oven, memiliki bobot sebesar 2,5 mg. Persyaratan yang harus dipenuhi yaitu bahwa sampel yang akan
diloadingkan ke dalam SPE tidak boleh 5 melebihi berat catdrige, sehingga SPE yang digunakan dalam penelitian
ini adalah harus lebih dari 50 mg. Semakin besar SPE yang digunakan kapasitas efisiensi penjerapan analit semakin
besar. Penelitian ini menggunakan SPE C
18
denga berat 400 mg.
Tabel XI. Penentuan kapasitas SPE Sigmaaldrich.
Bobot sampel
Volume SPE Minimum
volume eluat Kapasitas SPE
yang digunakan
50-100 mg 1 mL
100-200 uL 2,5-10 mg
500mg 3 mL
1-3 mL 25-100 mg
0,5-0,1 g 6 mL
2-6 mL 25-100 mg
2 g 12 mL
10-20 mL 0,1-0,2 g
5 g 20 mL
20-40 mL 1,25-2,5 g
10 g 60 mL
40-100 mL 0,5-1 g
Berdasarkan pada optimasi uji kualitatif pencucian SPE, SPE layak untuk digunakan berulang sebanyak 3 kali
dengan syarat setiap kali selesai pemakaian, SPE dicuci dengan 10 ml metanol dan 10 ml akuades. Berikut ini
adalah data dari penentuan kapasitas SPE C
18
:
Tabel XII. Optimasi penentuan kapasitas SPE C
18
R1 R2
R3 R4
Rata-rata gram Berat awal
zatgramml 0,793
0,788 0,796
0,792 Berat setelah
oven gram 0,003
0,003 0,003
0,001 0,0025
b Optimasi washing SPE C
18
Optimasi SPE C
18
juga dilakukan pada tahap washing. Fraksinasi washing dilakukan dengan memvariasi pelarut
yang digunakan yaitu 5 MeOH dan 100 UPW. Pada fraksinasi dengan pelarut 5 MeOH sampel diadisi dengan
2 µl larutan standar intermediet A. Berikut grafik luas puncak AUC difenokonazol dengan hasil optimasi
washing dengan pelarut 5 MeOH dan 100 UPW:
Gambar 7. Luas puncak difenokonazol yang diperoleh dari hasil Fraksinasi setelah washing dengan 5 MeOH washing 1 vs 100 UPW
washing 2
Diagram diatas menjelaskan bahwa eluat setelah washing dengan 5 MeOH menghasilkan luas puncak yang lebih
kecil dibandingkan washing dengan 100 UPW.Artinya senyawa pada saat washing dengan 5 MeOH, analit
difenokonazol banyak yang hilang ikut tercuci sehingga saat diinjeksikan eluat menghasilkan respon luas puncak
1 2
A U
C
fraksinasi setelah washing
160506
568132,5
Washing 1
yang lebih rendah dibandingkan dengan eluat setelah washing menggunakan 100 UPW.
c Optimasi elusi SPE C
18
Optimasi elusi SPE C
18
dilakukan dengan fraksinasi menggunakan pelarut metanol dan konsentrasi adisi 2µL
larutan standar stok A yang memiliki konsentrasi sebesar 0,526
gL
. Berikut grafik fraksinasi elusi dengan pelarut metanol :
G Gambar 8. Luas puncak hasil elusi difenokonazol
dalam SPE C
18
per mL metanol
1 2
3 4
5
AUC
jumlah Metanol untuk elusi ml
342216,75
336295 82787
30562,5
Gambar diatas menjelaskan bahwa dengan 3 mL pelarut MeOH sudah cukup untuk mengelusi analit yang
diharapkan. d
Optimasi kelayakan penggunaaan SPE secara berulang Penggunaan SPE berulang dalam penelitian ini
didasarkan pada hasil optimasi yang menyatakan bahwa SPE C
18
400 gram dapat digunakan tidak lebih dari tiga kali. Optimasi dilakukan dengan mengaplikasikan standar
difenokonazol 0,789 ng ke dalam sebuah SPE yang sama sebanyak tiga kali. Tujuan dari optimasi ini adalah untuk
melihat perolehan
kembali. Diharapkan
bahwa penggunaan SPE berulang tidak mempengaruhi perolehan
kembali dari masing-masing sampel.
Tabel XIII. Recovery optimasi kelayakan penggunaan SPE berulang
Massa ng
AUC DCB
AUC difenokonazol
Ratio Recovery Kesalahan
0,789 16110,5
30015,1 1,863
110,743 10,74292
0,789 20158,1
36603,9 1,816
109,349 9,349369
0,789 25368,2
46977,3 1,852
107,309 7,309574
Rata-Rata 1,8437
109,134 9,133954
SD 1,727
RSD 1,583
Berdasarkan pada data diatas didapatkan kesalahan ≤20 yang berarti bahwa data optimasi memenuhi kriteria
persyaratan dan bahwa SPE dapat digunakan 3 kali AOAC,2005.
Hasil optimasi clean-up dengan SPE C
18
pada penelitian ini adalah sebagai berikut:
Tabel XIV. Hasil optimasi clean-up SPE C
18
Optimasi Hasil
Kapasitas SPE C
18
≥ 50 mg, yang digunakan 400 mg
Washing SPE 5 mL akuades
Elusi SPE 3 mL metanol
C. Validasi Metode Analisis
