Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Sebanyak 5 gram

menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon supernatan sebelumnya kemudian ditambahkan 2µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 1 mL akuabides kemudian di-degassing dengan ultrasonifikator selama 5 menit selanjutnya aplikasikan sampel ke dalam kolom SPE C 18 . Washing dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL kemudian keringkan kolom dengan bantuan gas nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan 1 mL ; 2 mL ; 3 mL ; 4 mL ; 5 mL metanol. Masukan metanol ke dalam flakon untuk mencuci ekstrak, kemudian aplikasikan ke dalam kolom SPE. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon. Sampel dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem GC- ECD.

5. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Sebanyak 5 gram

buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan asetonitril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon supernatan sebelumnya lalu ditambahkan 7 µL ; 10 µL Standar stok C dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 0,5 mL akuabides kemudian diultrasonifikasi selama 5 menit. Sampel yang telah di-degassing dengan ultrasonifikator diambil dengan pipet Pasteur untuk dimasukan ke dalam SPE. Washing sampel dalam flakon berisi ekstrak dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL dan diaplikasikan dalam kolom SPE C 18 lalu keringkan kolom dengan bantuan aliran nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan metanol. Metanol digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga semua ekstrak tercuci bersih, aplikasikan ke dalam kolom SPE C 18 . Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem GC-ECD. 6. Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis merupakan serangkaian proses yang dilakukan untuk membuktikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Perbedaaan langkah kerja validasi metode dengan uji kesesuaian sistem adalah kurva baku yang digunakan. Kurva baku yang digunakan dalam validasi metode analisis adalah kurva baku metode adisi dengan menggunakan matriks ekstrak buah melon sedangkan pada uji kesesuaian sistem kurva baku yang digunakan adalah kurva baku solven. Di bawah ini merupakan langkah kerja secara umum untuk mendapatkan ekstrak buah melon yang siap diadisi: Sebanyak 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan asetonitrril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon supernatan sebelumnya kemudian ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 0,5 mL akuabides kemudian didegassing selama 5 menit. Sampel yang telah di-degassing dengan ultrasonifikator diambil dengan pipet Pasteur untuk diaplikasikan ke dalam kolom SPE. Washing sampel dalam flakon berisi ekstrak dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL lalu keringkan kolom dengan bantuan aliran nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan metanol. Metanol digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga semua ekstrak tercuci bersih, lalu sedikit demi sedikit ekstrak tersebut diaplikasikan ke dalam kolom SPE C 18 . Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Ekstrak yang didapatkan digunakan sebagai matriks untuk melakukan validasi metode analisis. Parameter validasi metode yang dinilai adalah sebagai berikut : a. Presisi keterulangan sistem GC-ECD. Presisi dapat ditentukan dari nilai CV. Parameter presisi dapat diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL larutan ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol stok B 1ul, 3ul, 5ul, 7ul, 10ul, 13ul, 15ul, 20ul, ke dalam sistem GC-ECD sebanyak 3 kali. Respon yang berupa luas puncak difenokonazol dari masing-masing konsentrasi larutan baku yang diperoleh dihitung nilai rata-rata, SD dan CV. b. Linearitas hubungan konsentrasi baku difenokonazol dengan respon sistem GC-ECD. Koefisien korelasi r merupakan parameter yang diperlukan untuk menentukan linearitas hubungan massa baku difenokonazol terhadap respon sistem GC-ECD yang telah optimal. Koefisien korelasi r diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL larutan ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol 0,053 ; 0,0789 ; 0,105 ; 0,132 ; 0,184 ; 0,263 ; 0,395 ;0.526 ngµL ke dalam sistem GC- ECD. Linearitas hubungan antara massa difenokonazol yang diinjeksikan terhadap respon alat, diplotkan dalam bentuk kurva baku dan dihitung parameter statistiknya seperti intersep a, slope b, dan koefisien korelasi r dengan menggunakan program powerfit. c. Sensitivitas sistem GC-ECD. Sensitivitas sistem GC-ECD yang telah optimal dapat diketahui dengan menghitung nilai IDL dan slope. Kedua parameter sensitivitas tersebut dapat ditetapkan dengan menginjeksikan 2 µL larutan baku difenokonazol dengan konsentrasi kurva baku adisi ke dalam sistem GC-ECD. Nilai IDL dan slope dapat dihitung dari persamaan kurva baku hasil injeksi. G. Analisis Hasil 1. Uji kesesuaian instrument GC-ECD a. Analisis hasil optimasi sistem GC-ECD. Analisis hasil optimasi sistem GC- ECD dapat dilihat pada kromatogram yang dihasilkan. Optimasi kecepatan alir gas, inisial temperatur, suhu injektor, suhu kolom, suhu detektor dan suhu oven yang optimal akan memberikan pemisahan puncak senyawa yang optimum. b. Analisis Kinerja instrumen GC-ECD. GC-ECD yang telah optimal untuk analisis kadar residu difenokonazol, dibuktikan oleh nilai Rs, TF, N, dan tR yang memenuhi syarat-syarat batasan yang harus dicapai sebagaimana telah dijelaskan pada beberapa teori . 1 Waktu retensi tR.Waktu retensi dari masing-masing senyawa dapat dilihat pada kromatogram yang dihasilkan. Keajegan rasio tRstandar internal dan rasio AUC standarDCB dari penginjekan 6 kali. Kejegannya dihitung dengan rumus RSD: RSD = 100-recovery Harmita,2004. 2 Daya pisah resolusi. Resolusi dalam penelitian ini ada 2 yaitu resolusi awal dan resolusi akhir. Resolusi dapat dihitung dengan rumus: Rs= Keterangan : tR= waktu retensi W1 dan W2 = rata-rata lebar zona 3 Tailing factor TF. Tailing factor atau TF dapat diterima apabila memiliki nilai 1,2. Jika TF lebih 1,2 maka puncak kromatogram tersebut mengalami tailing pengekoran Dolan et al,2002 TF= 4 Jumlah lempeng teoritik N. Jumlah lempeng teoritik atau N dapat dihitung dengan rumus : N= 16 2 Keterangan : tR: waktu retensi Wb=lebar dasar puncak c. Analisis hasil kinerja instrumen GC-ECD secara Kuantitatif. Analisis hasil Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD secara kuantitatif menghitung parameter- parameter yang dibutuhkan, berikut ditentukan syarat-syarat nilai parameter dari nilai CV, r, IDL, dan slope yang harus dicapai agar suatu sistem GC-ECD dapat dinyatakan sesuai untuk penentuan kadar difenokonazol. 1 Linearitas Linearitas ditentukan dari nilai koefisien korelasi r yang diperoleh dari kurva baku solven hasil plot antara rasio luas puncak difenokonazolDCB dan massa standar baku yang diinjeksikan kedalam regresi linear dengan persamaan y = a + bx dengan menggunakan powerfit. 2 Sensitivitas Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung nilai slope, IDL, IQL dengan rumus : Slope dapat diperoleh dari persamaan regresi linear y=a+bx b=slope; a=intersep IDL dapat dihitung dengan rumus: 3,3 × Keterangan: S a standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope k=3,3. 3 Presisi keterulangan Nilai presisi atau keterulang dapat diperoleh dengan menghitung kesalahan acak KV dengan rumus: Kesalahan Acak KV= x 100 4 Percent Difference D Percent Difference D dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut D= x 100 d. Analisis hasil Optimasi Preparasi Sampel. Pengecekan kadar air dalam buah melon.Kadar air didalam melon dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Kadar air = x 100 e. Validasi metode analisis Hasil modifikasi QuEChERS dan clean-up 1 Linearitas Linearitas suatu kurva baku ditentukan oleh nilai koefisien korelasi r. Koefisien korelasi dapat diperoleh dengan mengeplotkan data antara rasio luas puncak difenokonazolstandar internal DCB sebagai sumbu y dengan konsentrasi difenokonazol sebagai sumbu x ke dalam program Powerfit® sehingga didapatkan persamaan regresi linear y= a + bx. 2 Selektifitas. Data kromatogram antara sampel sebelum dan sesudah SPE dibandingkan selain itu resolusi antara puncak analit difenokonazol dengan puncak terdekat dihitung ICH Harmonised Tripartite,2005. 3 Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus : Perolehan kembali recovery = × 100 4 Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus : Kesalahan Acak RSD = × 100 5 Sensitivitas. Limit of QuantitationLOQ dihitung dengan rumus : 10 × Keterangan: S a standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope k=10 6 Limit of Detection LOD. Limit of Detection LOD suatu sistem GC-ECD dapat dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear suatu kurva baku. Berikut adalah rumus untuk menghitung LOD: LOD= 3,3 × Keterangan: S a standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope, k=3,3 ICH Harmonised,2005.

H. Rancangan Penelitian