UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pendingin tabung penerima, gosok dengan karet yang diikatkan pada sebuah kawat tembaga dan basahi dengan toluen hingga
tetesan air turun. Setelah air dan toluen memisah sempurna, baca volume air. Hitung kadar air dalam persen.
3.4.4 Penyiapan Hewan Coba
Tikus jantan galur Sprague-Dawley diaklimatisasidi animal house Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan selama 4 minggu.
Diberi makan dan minum ad libitum. Bawang putih Allium sativum kasar diberikan secara oral menggunakan sonde sekali setiap hari
selama 30 hari dengan dosis seperti tertera pada tabel rancangan percobaan Tabel 4.
3.4.5 Pengukuran Parameter
1. Perhitungan konsentrasi spermatozoa
Perhitungan konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara mengambil spematozoa pada kauda epididimis. Spermatozoa yang
didapat diletakkan dalam cawan penguap yang berisi cairan NaCl sebanyak 500 µL. Spermatozoa dimasukkan ke dalam kamar
Neubauer Hemasitometer sampai kamar Neubauer terisi rata. Kemudian dihitung jumlah spermatozoa pada salah satu kamar hitung
Neubauer dan selanjutnya ditentukan pengenceran yang akan dilakukan dan jumlah kotak yang akan dihitung Tabel 5 Ilyas,
2007
No. Jumlah
Spermatozoa dalam 1 kotak
Faktor pengenceran
Kotak kecil yang dihitung
1 40
50 kali 5
2 15-40
20 kali 10
3 15
10 kali 25
Tabel 5. pengenceran yang dilakukan dan kotak yang dihitung
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Dari sejumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang
terhitung Ilyas, 2007.
No. Pengenceran
Pembuatan Pengenceran 1
50 kali a.
980 µL larutan George + 20 µL spermatozoa
b. 2.450 µL larutan George + 50 µL
spermatozoa 2
20 kali 950 µL larutan George + 50 µL spermatozoa
3 10 kali
a. 900 µL larutan George + 100 µL
spermatozoa b.
450 µL larutan George + 50 µL spermatozoa
Setelah pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai dengan jumlah spermatozoa dan
cara pengenceran pada tabel 5. kemudian dilakukan pengukuran konsentrasi spermatozoa sesuai dengan rumus di bawah ini Ilyas,
2007.
Keterangan: n
: jumlah spermatozoa yang dihitung 10.000 : volume kamar hitung Neubauer
Fp : faktor pengenceran
25 : total kotak kecil yang terdapat dalam kamar hitung
Neubauer k
: kotak kecil yang dihitung pada saat pengamatan
Tabel 6. Cara Pengenceran
Konsentrasi Spermatozoa = n x 10.000 x Fp x
25 �
x vNaCl...3.1
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
vNaCl : volume NaCl fisiologis ml yang digunakan untuk membantu mengeluarkan spermatozoa jutaml dapat terlihat dari
tabel 7 berikut.
No. Jumlah kotak
yang dihitung Rumus konsentrasi Spermatozoa
1 5
n x 10.000 x 50 x 5 x 0,5 2
10 n x 10.000 x 20 x 2,5 x 0,5
3 25
n x 10.000 x 10 x 1 x 0,5
2. Konsentrasi hormon testosteron
Selama 30 hari tikus diberikan perlakuan dengan cara memberikan serbuk bawang putih peroral. Pada hari ke-0 dan ke-31
dilakukan pengambilan darah melalui vena lateral ekor sebanyak 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tube. Setelah 24 jam dari
perlakuan terakhir, berat tikus yang terakhir dicatat. Darah dikumpulkan. Serum dipisahkan dengan cara sentrifugasi pada 3000 g
selama 10 menit dan disimpan pada -20 C sampai digunakan untuk
assay biokimia Krishna, 2012. Prosedur pengukuran kadar testosteron menggunakan kit
ELISA, larutan standar, kontrol dan sampel, dipipet masing-masing sebanyak 25 uL ke dalamwells. Enzyme conjugate dipipet sebanyak
200 uL ke dalam setiap wells ,kemudian dicampurkan selama 10 detik. Hal yang penting adalah tahap pencampuran hingga selesai.
Campuran tersebut kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruangan tanpa menutup plate, wells kemudian digoyangkan dengan
cepat. Wells diteteskan dengan wash solution 400 uL per well, wells diletakan di atas kertas penyerap untuk menghapus sisa tetesan.
Substrate solution sebanyak 200 uL ditambahkan ke dalam wells. Setelah itu diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruangan.
Penghentian reaksi enzimatik dilakukan dengan penambahan stop solution sebanyak 100uL ke dalam setiap wells. Tentukan nilai
Tabel 7. Rumus Konsentrasi Spermatozoa
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
absorbansi setiap wells pada 450 ± 10 nm dengan microtitter plate reader waktu yang direkomendasikan untuk membaca nilai absorbansi
setiap wells adalah 10 menit setelah penambahan stop solution.
DRG® Testosterone Rat ELISA, 2013.
3. Aktivitas Spermisidal
Aktivitas spermisidal ditentukan dengan menggunakan versi modifikasi dari protokol asli Sander dan Metode Cramer yang
mengukur konsentrasi minimum zat spermisida yang dibutuhkan untuk membunuh 100 sperma dalam 20 detik. Tikus yang digunakan
adalah tikus yang fertil. Tikus kemudian dikorbankan untuk mengambil kauda epididimis kemudian semen dikumpulkan dan
diinkubasi dengan normal saline water untuk uji in vitro dari sperma tikus. Sperma yang digunakan memiliki motilitas ≥50 dan
konsentrasi sperma ≥ 20 jutaml Ashish Ranjan, Singth, 2013.
Uji serbuk umbi lapis bawang putih dilakukan pada berbagai konsentrasi 150, 170, 190, 210, 230 dan 250 mgml yang
dicampurkan ke dalam suspensi sperma yang mengandung 1 juta sperma. Campuran tersebut diamati dibawah mikroskop selama 20
detik di perbesaran 10 X dan dicatat motilitas sperma. Konsentrasi dicatat jika ada sperma motil yang terlihat. Lalu 250 uL buffer
ditambahkan ke semua campuran dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama minimal 60 menit. Larutan tersebut perlahan-lahan di vortex
dan diamati lagi setiap sperma yang motil. Konsentrasi dicatat sebagai hasil yang efektif jika kedua tes menunjukkan tidak adanya sperma
motil. Titik akhir adalah konsentrasi terendah dari serbuk umbi lapis bawang putih yang menyebabkan imobilisasi semua sperma dalam 20
detik pencampuran Ashish Ranjan Singth, 2013.
3.5 Analisa Data
