V
2
= Volume yang dibutuhkan untuk melakukan perlakuan 96 sumur x 150 µl = 14,4 ml
M
2
= Konsentrasi mikroba yang diharapkan 10
6
2. Pengujian Pembentukan Biofilm
Berdasarkan prosedur yang dilakukan oleh Yamanaka 2004, maka larutan bakteri, PBS, dan BHI selanjutnya diiisikan ke dalam Tissue
Culture Plate 96 sumur sebanyak 150 µl. Penelitian ini menggunakan dua
spesies mikroba, oleh karena itu Tissue Culture Plate yang ada dibagi menjadi dua bagian terlebih dahulu. Bagian kanan akan diisi oleh
Streptococcus mutans serotipe d dan sebelah kiri Streptococcus mutans
serotipe c. Pengujian dilakukan dengan memasukkan perlakuan ke dalam
setiap sumur yang tersedia. Pada sumur baris pertama tidak diberikan perlakuan apapun dan bertindak sebagai kelompok kontrol. Sumur baris
kedua diberi 50 µl formula uji A yang mengandung sukrosa, glukosa, minyak kayu putih, dan minyak peppermint. Sumur ketiga diberi 50 µl
formula kombinasi komponen flavor yang terdiri dari minyak kayu putih dan peppermint formula uji B. Sumur ketiga diisi formula uji C yang
merupakan pengujian untuk komponen flavor tunggal minyak kayu putih, dan sumur keempat diisi oleh komponen flavor tunggal minyak
peppermint formula D. Blanko pada pengujian ini hanya berisi media
yang tidak ditumbuhi oleh mikroba dan tidak diberikan perlakuan. Penelitian berikutnya adalah pengujian pengaruh konsentrasi
minyak kayu putih terhadap pembentukan biofilm kedua spesies. Maka sumur pada baris kelima, keenam, dan ketujuh hanya diisi oleh komponen
flavor tunggal minyak kayu putih, pada konsentrasi yang telah dibuat pada formula uji yaitu formula D, E, dan F. Pembagian sumur dan perlakuan
dapat dilihat pada Gambar 7. Tissue Culture Plate
yang sudah terisi tersebut selanjunya diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37
o
C, dengan kondisi anaerobik kadar CO
2
5 pada kelembaban 95 selama 24 jam Yamanaka, 2004.
Setelah 24 jam inkubasi semua cairan yang ada pada tiap sumur dibuang dengan menggunakan pipet sehingga meninggalkan biofilm yang melekat
pada dasar sumur. Tiap sumur yang mengandung biofilm kemudian dicuci sebanyak 3 kali dengan larutan PBS yang bertujuan untuk membersihkan
sisa setiap perlakuan.
Gambar 7. Pembagian Sumur dan Perlakuan Tahap selanjutnya adalah tahap pemberian kristal violet 0,5
terhadap biofilm yang menempel di dasar sumur. Setiap sumur diisi dengan cristal violet 0,5 sebanyak 200 µl, dan ditunggu selama 15 menit
untuk kemudian dicuci dengan air sebanyak 200 µl. Sumur yang telah terwarnai kemudian diangin-anginkan pada suhu ruang dengan kondisi
steril. Setelah kering, sumur kemudian ditambahkan etanol 95 sebanyak 200 µl yang bertujuan untuk melepaskan kristal violet yang masih
menempel pada sel bakteri. Setelah biofilm terlepas didapatkan suspensi biofilm dan etanol. Mikroplate yang telah berisi suspensi selanjutnya
dimasukkan kedalam microplate readerELISA reader pada panjang gelombang
λ 490 nm. Pengukuran ini akan menghasilkan nilai OD. Nilai OD adalah
nilai atau tingkat kemampuan gelombang cahaya untuk menembus suatu S. mutans
Seotipe C S. mutans
Seotipe D
Kontrol Formula A
Formula B Formula C
Formula D Formula E
Formula F Blanko
larutan atau suspensi. Semakin tinggi nilainya, maka semakin banyak biofilm bakteri yang terdispersi dalam suspensi SDS tersebut Honda,
2005.
3. Analisis Kuantitatif Kedua Spesies
