20
spuit jarum suntik. Cairan yang keluar dari kedua epididimis dicampur di atas gelas objek untuk dihomogenkan.
3.5 Parameter Penelitian
Sampel dievaluasi setiap hari selama 5 hari berturut-turut secara mikroskopis yang meliputi motilitas spermatozoa, persentasi hidup spermatozoa,
persentasi keutuhan membran spermatozoa, persentasi cytoplasmic droplet spermatozoa, dan persentasi abnormalitas lain spermatozoa sebagai berikut:
a. Konsentrasi Spermatozoa Konsentrasi spermatozoa hanya diukur sekali saja pada hari ke-0
menggunakan kamar hitung Neubauer. Pertama dilakukan pengenceran 500X dengan cara mencampurkan 1 µL cairan epididimis dengan 499 µL formal saline.
Setelah homogen diteteskan ke dalam kamar hitung Neubauer, pengamatan dilakukan dengan prbesaran 400X dengan menghitung jumlah spermatozoa yang
tedapat dalam lima kotak haemocytometer yaitu satu kotak pada tiap ujung dan satu kotak di tengah. Konsentrasi spermatozoa dihitung dengan rumus berikut:
Konsentrasi spermatozoa = Σ spermatozoa × 25x10
6
selml. b. Motilitas Spermatozoa
Pemeriksaan motilitas dilakukan dengan mencampur 1 tetes cairan epididimis dengan 3 tetes NaCl fisiologis pada gelas objek kemudian dihangatkan.
Pengamatan motilitas dilakukan secara objektif dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100X yang dinilai dalam .
c. Keutuhan membran Spermatozoa Pemeriksaan keutuhan membran dilakukan dengan metode hypoosmotic
swelling HOS test. Reagen HOS test yang digunakan adalah campuran 0.675
gram fruktosa dan 0.735 gram natrium sitrat dalam 50 ml aquades. Campuran 9 tetes reagen HOS test dengan 1 tetes cairan epididimis dalam tabung eppendorf
diinkubasikan dalam penangas air pada suhu 37 C selama 30 menit. Evaluasi
dilakukan dengan meneteskan campuran di objek gelas kemudian menghitung
21
jumlah spermatozoa yang membrannya masih utuh dalam beberapa layang pandang dengan jumlah sel minimal 200 sel. Spermatozoa yang membrannya
masih utuh ditandai dengan ekor sperma yang melengkung Gambar 4. Persentase membran plasma utuh dihitung dengan rumus berikut:
Persentase membran plasma utuh =
.
Gambar 5 Skema perubahan morfologi spermatozoa akibat kondisi hipoosmotik. a spermatozoa normal; b sampai g beragam tipe perubahan ekor
WHO 2010 d. Spermatozoa Hidup
Pemeriksaan spermatozoa hidup mati dilakukan dengan menggunakan 3 gelas objek yang bersih dan bebas lemak. Dua tetes eosin nigrosin dicampur
dengan cairan epididimis, setelah homogen lalu membuat preparat ulas, kemudian dipanaskan sampai kering. Spermatozoa yang hidup ditandai dengan tidak
terwarnai spermatozoa karena tidak menyerap warna. Jumlah spermatozoa yang hidup dihitung dalam beberapa layang pandang dengan jumlah sel minimal 200
sel. Persentase spermatozoa hidup dihitung dengan rumus berikut: Persentase spermatozoa hidup
= .
e. Abnormalitas Spermatozoa Pemeriksaan abnormalitas spermatozoa dilakukan dengan memeriksa
persentasi spermatozoa yang masih memiliki cytoplasmic droplet dan spermatozoa yang mengalami abnormalitas lain seperti ekor patah, ekor
22
melingkar, ekor ganda dan sebagainya. Pengukuran menggunakan preparat ulas yang telah dibuat pada pemeriksaan spermatozoa hidup sebelumnya.
Penghitungan dilakukan hingga jumlah spermatozoa minimal 200 sel dalam beberapa lapang pandang. Persentase abnormalitas spermatozoa dihitung dengan
rumus berikut: Persentase abnormalitisa spermatozoa
= .
3.6 Protokol Penelitian
