4 dan 10
-6
disebar sebanya k 0,1 mℓ pada cawan petri berisi media TSA lalu
diinkubasi pada suhu 27-30 °C selama 24 jam. Setelah 24 jam, koloni tunggal yang tumbuh pada media kultur dan
memiliki profil berbeda diambil menggunakan ose lalu digores pada cawan petri berisi media TSA steril dengan metode gores kuadran. Isolat yang telah digores
tersebut diinkubasi kembali pada suhu 27-30 °C selama 24 jam untuk mendapatkan isolat tunggal yang murni. Isolat murni dipindahkan ke tabung
reaksi berisi media TSA steril untuk disimpan sebagai stok isolat bakteri kandidat probiotik dan digunakan untuk uji selanjutnya.
2.3 Uji Aktivitas Amilolitik dan Proteolitik
Uji ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim amilase dan protease yang dihasilkan oleh masing-masing isolat, untuk menunjukkan kemampuannya
dalam menghidrolisis karbohidrat dan protein. Bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan pada media brain heart infusion agar BHIA yang telah
ditambahkan pati sebanyak 2 untuk uji amilolitik. Kemampuan menghidrolisis karbohidrat ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni yang
tumbuh, setelah agar digenangi dengan reagen KI 1. Koloni yang tidak mampu menghidrolisis karbohidrat tidak terdapat zona bening di sekitar koloni yang
tumbuh. Pada uji aktivitas proteolitik, bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan pada
media BHIA yang telah ditambahkan susu skim sebanyak 2. Kemampuan menghidrolisis protein ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni
yang tumbuh. Isolat dengan aktivitas amilolitik dan proteolitik paling besar dipilih untuk diuji kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen
S. agalactiae isolat 5 tipe non-hemolitik Sa5.
2.4 Uji Sensitivitas Antibiotik
Uji ini dilakukan untuk menguji sensitivitas bakteri kandidat probiotik serta Sa5 pada beberapa jenis antibiotik serta membantu dalam pembuatan penanda
untuk memonitor keberadaan bakteri yang akan digunakan pada uji in vitro sehingga dapat dibedakan dengan jenis bakteri lain. Jenis antibiotik yang
digunakan adalah Rifampisin, Streptomisin, Kanamisin, dan Penisilin G. Konsentrasi yang digunakan untuk setiap jenis antibiotik tidak sama. Antibiotik
Rifampisin diuji pada konsentrasi 25 dan 100 μgmℓ, Streptomisin pada
5 konsentrasi 50 dan 100 μgmℓ, Kanamisin pada konsentrasi 50 dan 100 μgmℓ,
serta Penisilin G pada konsentrasi 50 dan 100 μgmℓ. Kandidat probiotik digoreskan pada media BHIA yang telah ditambahkan antibiotik dengan metode
streak plate lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28
-30 °C
. Bakteri yang sensitif terhadap antibiotik ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan koloni
pada media BHIA yang mengandung antibiotik, sedangkan bakteri yang resisten akan tetap tumbuh pada media tersebut.
2.5 Penyiapan Bakteri Resisten Antibiotik
