21 Perbedaan komposisi media juga mempengaruhi produksi senyawa
penghambat Verschuere et al. 2000. Selain itu, percobaan yang telah dilakukan sebelum uji antagonistik in vitro memperlihatkan hasil secara visual yang kurang
baik, zona hambat yang dihasilkan oleh bakteri kandidat probiotik yang digoreskan terhadap bakteri patogen secara streakplate tidak terlihat jelas
Gambar 6. Hal tersebut membuktikan bahwa penghambatan pertumbuhan populasi tidak selalu dapat dilihat melalui metode zona bening metode Kirby-
Bauer, sehingga metode uji antagonistik in vitro yang digunakan adalah metode kultur bersama patogen dan kandidat probiotik pada media broth.
Sasanti 2008 juga melaporkan bahwa dari 110 isolat hasil isolasi dari terumbu karang, hanya 10 isolat saja yang potensial sebagai kandidat probiotik.
Lima diantaranya terbukti mampu menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi MR 5339 Rf R walaupun tidak menunjukkan adanya zona hambat pada uji in vitro
dengan metode Kirby-Bauer.
Keterangan: Panah merah menunjukkan zona bening yang dihasilkan tidak terlihat
jelas.
Gambar 6 Zona hambat yang dihasilkan kandidat probiotik terhadap patogen dengan metode cawan gores
Kepadatan bakteri kandidat probiotik serta S. agalactiae StR yang diuji dengan metode kultur bersama sebelumnya diukur dengan metode total plating
count TPC dan optical density OD menggunakan spektrofotometer. Pengukuran OD dilakukan pada panjang g
elombang 600 nm. Kepadatan bakteri diketahui dengan membandingkan nilai OD dengan jumlah koloni bakteri
yang dikultur selama 24 jam Lampiran 3.
3.6 Uji Patogenisitas Kandidat Probiotik
Uji patogenisitas kandidat probiotik dilakukan untuk menguji sifat patogen dari kandidat yang diisolasi dari alam. Paramater yang diamati adalah SR ikan
22 nila yang diinjeksi dengan isolat kandidat probiotik. Sebagai pembanding adalah
perlakuan kontrol yang diinjeksikan patogen S. agalactiae isolat 5 Sa5 yang dikultur selama 24 jam. Kandidat probiotik yang diuji antara lain L1k, RN21f,
K21c dan NB21b yang memiliki kemampuan terbaik dalam menghambat pertumbuhan patogen. Gambar 7 menyajikan kondisi SR harian setiap perlakuan
selama uji patogenisitas.
Keterangan: K2ic perlakuan injeksi kandidat probiotik kode K2ic; NB21b injeksi NB21b; L1k injeksi L1k; RN21f injeksi RN21f; Sa5 injeksi patogen
S. agalactiae isolat 5 tipe non-hemolitik.
Gambar 7 Survival rate SR harian selama uji patogenisitas Hal menarik dari Gambar 7 adalah pada perlakuan injeksi NB21b.
Survival rate pada perlakuan tersebut turun hingga 0 pada hari pertama. Berdasarkan pengamatan yang dilakukan setiap 4 jam selama 24 jam pertama
pascainjeksi, diketahui bahwa ikan pada perlakuan NB21b mulai mengalami kematian sejak 4 jam pertama dan berakhir pada 4 jam ke-2 tanpa mengalami
gejala klinis yang jelas Gambar 8, sehingga sementara dapat disimpulkan bahwa isolat NB21b bersifat mematikan ikan nila pada kepadatan injeksi
10
8
CFUmℓ.
A b
C Keterangan: a ikan mati tidak menunjukkan gejala klinis; b ikan mati dikumpulkan
dalam baskom; c ikan mati dalam akuarium perlakuan.
Gambar 8 Ikan perlakuan injeksi NB21b yang mengalami kematian pascainjeksi
23 Gambar 9 memperlihatkan SR perlakuan NB21b pada akhir pemeliharaan
adalah 0. Analisis statistik juga menunjukkan SR perlakuan NB21b berbeda nyata P0,05 terhadap semua perlakuan. Sedangkan tiga perlakuan lainnya
yakni K2ic, L1k dan RN21f dapat mempertahankan SR ikan nila masing-masing sebanyak 80, 100 dan 90. Berdasarkan analisis statistik perlakuan K2ic
berbeda nyata P0,05 terhadap L1k, namun tidak berbeda nyata P0,05 terhadap RN21f. Perlakuan L1k juga tidak berbeda nyata P0,05 terhadap
RN21f. Kontrol positif Sa5 berbeda nyata P0,05 terhadap semua perlakuan Lampiran 4.
Keterangan: K2ic perlakuan injeksi kandidat probiotik kode K2ic; NB21b injeksi NB21b; L1k injeksi L1k; RN21f injeksi RN21f; Sa5 injeksi patogen
S. agalactiae isolat 5 tipe non-hemolitik; Huruf superscript yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata P0,05.
Gambar 9 Survival rate SR akhir uji patogenisitas Kontrol positif yang digunakan Sa5 menunjukkan gejala klinis sejak hari
pertama pascainjeksi yakni stres yang ditandai dengan perubahan warna tubuh ikan nila menjadi lebih gelap dan garis-garis hitam vertikal pada tubuh ikan yang
terlihat lebih jelas. Selanjutnya, ikan nila yang diinjeksi dengan patogen S. agalactiae menunjukkan gejala-gejala penyakit Streptococcosis hingga hari
ke-8 pemeliharaan. Berdasarkan hasil uji patogenisitas ini, dipilih satu isolat yang akan diuji kemampuan antagonistiknya secara in vivo yakni isolat L1k yang
mampu mempertahankan SR paling tinggi. Selain itu, L1k dipilih karena pada uji antagonistik secara in vitro isolat ini juga memiliki kemampuan menghambat
pertumbuhan patogen paling optimal diantara isolat-isolat yang diujikan.
24
3.7 Uji Antagonistik In Vivo
