Gen TNFα, Polimorfisme gen TNFα dan perannya terhadap

menunjukkan bahwa fibroblas yang diisolasi dari pasien dengan sekret fibrosis paru adalah faktor yang menginduksi apoptosis dari sel epitel alveoli. Dijumpainya hal ini membuat kita berhipotesis bahwa TNFα juga berperan penting pada patogenesis perubahan empisema pada pasien dengan PPOK dengan induksi apoptosis sel alveoli tipe II yang berfungsi sebagai stem sel untuk memperbaiki alveoli yang rusak Sakao, 2002. TNF α juga sebagai pengatur utama regulasi dari MMP Matriks Metaloproteinase yang merupakan patogenesis terjadinya PPOK oleh asap rokok. Ketidakseimbangan antara protease dan antiprotease berperan dalam terjadinya kelainan emfisema ditandai dengan meningkatnya degradasi dari matriks ekstraseluler, airway remodeling pada bronkitis kronik dan asma dan dengan adanya peningkatan penumpukan kollagen.TNF α dapat mengaktifkan makrofag untuk memproduksi matriks metaloproteinase. Efek ini di inhibisi oleh IL10, yang juga meningkatkan pelepasan tissue inhibitor metaloproteinase TIMP1 pada makrofag orang sehat, tetapi pada perokok IL10 meningkatkan pelepasan TIMP1 tanpa memodifikasi pelepasan MMP9 dari makrofag alveoliWright, 2007.

2.3.1 Gen TNFα, Polimorfisme gen TNFα dan perannya terhadap

timbulnya PPOK Regulasi dan produksi TNFα disandi oleh Gen TNFα yang pada manusia berada secara berdampingan pada lokus p21.3 kromosom 6 tepatnya terletak pada Major Histocompatibility Complex MHC kelas III Universitas Sumatera Utara De Vries, 2000. MHC mengakomodasi gen-gen yang memegang peranan penting dalam fungsi imunologis. Kompleks MHC dikelompokkan menjadi empat kelas dimana setiap kelas mengandung gen-gen yang mempunyai karakter berkaitan. Lokasi paling ujung dekat dengan sentromer merupakan kelas II yang terdiri dari 17 HLA human leukocyte antigen. Di sebelahnya mendekati arah telomere adalah kelas III yang mengkode beberapa komponen dan sistem komplemen. Sedangkan ujung lain yang paling dekat dengan telomere adalah kelas I yang mengkode lebih dari 18 gen yang berhubungan dengan HLA dan pseudogen. Akhir-akhir ini gen-gen yang bertanggung jawab terhadap inflamasi dan infeksi yang terletak di bagian tengah MHC dan berbatasan dengan kelas III telah dikelompokkan sendiri dan dikategorikan sebagai kelas Ivsepertiterlihatpadagambar7. Gambar 7. Peta gen major histocompatibility complex MHC Gruen, 1997.Keterangan: Gen TNFα terletak pada kelompok kelas IV. Universitas Sumatera Utara Gen TNFαmempunyai ukuran 3.634 pb pasang basa yang tersebar pada empat ekson dan 7.092 pb yang tersebar pada tiga intron. Protein prekursor dengan ukuran 230 asam amino ditranslasikan dari mRNA dengan ukuran 1.585 pb Gambar 8. Protein prekursor dengan ukuran 230 asam amino tersebut berupa protein transmembran dengan berat molekul 25 kDa. Setelah melewati membran sel yang berupa lipid bilayer, protein tersebut diproses oleh enzim TNF alpha converting enzyme TACE menghasilkan sitokin TNFα fungsional dengan ukuran 157 asam amino dan berat molekul 17 kDa. Sitokin tersebut stabil dan aktif dalam konformasi saling berikatan membentuk homotrimer dengan berat molekul 51 kDa Grana, 2001. Gambar 8: Proses ekspresi gen TNFα Nedwin, 1985 Keterangan: Garis menggambarkan intron, sementara kotak menggambarkan ekson. Kotak putih merupakan daerah yang tidak ditranslasikan UTR, kotak bergaris adalah daerah yang ditranslasikan tetapi hanya terdapat pada protein prekursor dan kotak gelap merupakan daerah kodon TNFαfungsional Universitas Sumatera Utara Meskipun produksi sitokin TNFα dipicu oleh proses inflamasi, kecepatan produksi TNFα dipengaruhi oleh faktor genetik, yaitu adanya polimorfisme yang terdapat pada gen yang menyandi sitokin tersebut. Sejauh ini, 2 single nucleotide polymorphisms SNPs pada daerah promoter gen TNF α pada lokasi nukleotida -238 dan -308 dari gen TNF αtranscriptional start site telah ditemukan. Keduanya melibatkan perubahan nukleotida dari guanine G ke adenine A. Jenis-jenis alelnya secara berturut-turut adalah TNF α-238GA dan TNFα-308GA. Polimorfisme gen TNFα -308 baik yang homozigot AA maupun heterozigot GA merupakan faktor risiko terjadinya PPOK Huang, 1997. Polimorfisme genTNFα pada posisi -238 baik yang homozigot AA maupun heterozigot GA berhubungan dengan penurunan aktifitas transkripsi dan penurunan produksi TNFαGingo, 2008. Gen TNFα yang memiliki rantai panjang 233 asam amino dan terdapat pada bagian lengan pendek kromosom 6 p21.3 berada di dalam kompleks MHC,ini adalah región yang kejadian polimorfismenya sangat tinggi. Polimorfisme atau Single Nucleotida Polimorphism SNP adalah suatu variasi urutan nukleotida, atau perubahan salah satu basa nukleotida pada gen. Ada banyak penelitian yang menunjukkan polimorfisme gen TNFα mempengaruhi tingkat produksi dari TNFα. Perubahan yang terjadi adalah transition basa nukleotida purin Guanin menjadi basa nukleotida purin Adenin dilokasi -308 gen TNFα -308GA pada promotor region ‘5 dan merupakan kejadian polimorfisme yang akan menyebabkan peningkatanproses transkripsiHajeer,2000. Universitas Sumatera Utara Untuk mendapatkan polimorfisme ini bisa dideteksi dengan metoda PCR Polymerase Chain Reaction dan RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism, adapun primer yang digunakan pada penelitian ini untuk amplifikasi gen dengan PCR yaituprimer ATF-3 5’ GTT CCT TGG AAGCCA AGA CT 3’ dan ATR-1 5’ GTC AGG GGA TGT GGC GTC T 3’ padatahap reaksi pertama dan primer ATF-2 5’ TGG AGG CAA TAG GTT TTG AGGGCC AT 3’ dan ATR-2 5’ TCA TCT GGA GGA AGC CGT A 3’ untuk reaksiPCR kedua Turyadi, 2006. Produk PCR yang dihasilkan adalah sebesar 231pb. Dengan tehnik RFLP jika terdapat mutasi maka akan terdeteksi dengan tidak terpotong tidak diretriksi.Sedangkan pada yang normal terpotong menjadi 208pb dan 20pb oleh enzim NcoI. Dan pada yang heterozigot menjadi tiga pita yaitu 231pb, 208pb dan 20pb. Turyadi, 2006.Adapun nomor akses dari gen - 308 TNFα adalah rs1800629 Gingo, 2008. Sedangkan untuk gen TNFα posisi-238 dengan nomor akses rs361525,perubahan yang terjadi adalah transition basa nukleotida purin Guanin menjadi basa nukleotida purin Adenin dilokasi -23 8 TNFα - 238GA pada promotor region ‘5 dan merupakan kejadian polimorfisme yang akan menyebabkan peningkatan proses transkripsi. Untuk mendapatkan polimorfisme ini bisa dideteksi dengan metoda PCR Polymerase Chain Reaction dan RFLP, adapun primer yang digunakan untuk amplifikasi gen dengan PCR yaituforward 5’- ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3’dan reverse 5’- AGAAGACCCCCCTCGGAACC-3’. Produk PCR yang dihasilkan adalah Universitas Sumatera Utara sebesar 150pb. Dengan tehnik RFLP jika terdapat mutasi maka akan terdeteksi dengan tidak terpotong tidak diretriksi. Pada yang normal akan dikenal dan diretriksi menjadi 130 pb dan 20pb oleh enzim MspI. Heterozigot akan diretriksi menjadi 150pb, 130pb dan 20pb Ozhan, 2010. Faktor yang menyebabkan peningkatan TNFdalam penderita PPOK tetapi tidak pada perokok dengan fungsi paru normal satu kemungkinannya adalah bahwaekspresi TNF diatur oleh single nucleotide polimorfisme SNP dalam gen. Hal ini telah dibuktikan dari beberapa penelitianadanyapeningkatan aktifitas transkripsi gen TNF yang dikaitkan dengan alel yang-308A, sedangkan pada -238 menyebabkan penurunan aktifitas trankripsi.Sudah dinyatakan dari beberapa penelitian bahwa polimorfisme gen dari TNFα, IL13 promotor gen, vitamin D protein pengikat, gen yang berhubungan dengan keseimbangan protease dan antiprotease dan dengan keseimbangan oksidasi dan antioksidan yang berkaitan dengan kejadian PPOK. Polimorfisme yang terjadi pada satu gen hanya menempati sebagian kecil risiko relatif dari terjadinya PPOK, dan sepertinya efek kumulatif dari banyak polimorfisme akan menjadi penting dalam patogenesisnya. Sebelum hubungan ini secara umum dapat diterima, semua itu satu-persatu harus dilakukan penelitian secara seksama dengan penelitian-penelitian lebih jauh untuk melihat hubungan dalam hal ke sukuan dan fenotipe dari PPOK Teramoto, 2007 Dari penelitian Louis 1998, Krouger1997, Wilson 1997, dan Wu 1997 dilaporkan tentang peningkatan aktivitas transkripsi gen TNF Universitas Sumatera Utara yang dikaitkan dengan alel yang -308A diberbagai gangguan. Higuchi 1998 melaporkan bahwa TNF merupakan sebuah ekspresi dari mononuklear darah perifer sel dan melaporkan adanya alel 857T dan alel 1031C yang dikaitkan dengan peningkatan transkripsional aktivitas gen TNF. Udalova2000 melaporkan tentang adanya alel 863A Tumor Nekrosis Faktor. Sementara alel -238A yang dilaporkan oleh Huizinga 1997, Pociot 1995, Hajeer2000 dan Gingo 2008 juga menunjukkan hasil yang beragam berkaitan dengan TNFα dan produksi protein. Meskipun ini telah dibuktikan dalam studi in vitro, belum semua dari SNP tersebut dipelajari pada populasi PPOK dan yang telah diteliti pun terkadang menunjukkan hasil yang bertentangan. Produksi TNF α menunjukkan variasi yang besar antar individu, hal ini sudah diketahui terutama dipengaruhi oleh faktor yang diturunkan. Beberapa polimorfisme genetik yang berhubungan dengan sintesa TNF α sudah ditetapkan pada gen TNF antara lain gen TNF α posisi -308 Huang, 1997, gen TNF α posisi -863 Gingo, 2008, gen TNFα posisi -238 Bayley, 2001 dan beberapa lainnya. Sampai saat ini masih menjadi perdebatan para ahli tentang pengaruh alel gen TNF α-308 GA dan -238GAterhadap kejadian Penyakit Paru Obstruktif Kronik PPOK. Sejak Huang1997 menemukan adanya polimorfisme gen TNF α-308GA pada populasi di Taiwan yang berperan terhadap terjadinya bronkitis kronik. Dan kemudian kembali dibuktikan polimorfisme nukleotida tunggal ini berhubungan dengan terjadinya PPOK oleh Sakao2001, Jiang2005 dan Hersh 2005. Universitas Sumatera Utara Namun hal ini tidak konsisten dijumpai keberadaanya, seperti yang dilaporkan beberapa penelitian Higham2000, Sandford 2001, Tanaka2007 yang dilakukan pada populasi Kaukasus dan oleh Ishi 2000, Hegab2005 dan Chierakul2005 pada populasi Asia, diperoleh bahwa polimorfisme nekleotida tunggal alel -308GA TNF α tidak berbeda bermakna antara perokok dengan atau tanpa PPOK. Hu 2007 di Cina dan Gingo 2008 di Amerika mengkonfirmasi kembali adanya hubungan polimorfisme nukleotida tunggal alel gen TNF α-308GA dengan PPOK dan berperan terhadap kerentanan pada seorang perokok. Gingo 2008 membandingkan 6 variasi polimorfisme TNFα nukleotida tunggal -1031CT, -863CA, -857CT, -238GA, -308GA dan +487GA dan disimpulkan bahwa alel -308 memiliki odds rasio yang paling tinggi berhubungan dengan analisis multivariat dan juga berhubungan dengan memburuknya nilai VEP 1 KVP dan yang kedua berhubungan secara bermakna adalah -238 . Dan Gingo menyatakan diperlukan penelitian independen yang dilakukan pada populasi Kaukasia dan populasi non-Kaukasia.Penelitian metaanalisis terhadap sejumlah penelitian yang dilakukan selama 20 tahun sebelumnya mengenai 20 polimorfisme pada 12 macam gen yang dilakukan oleh Smoolonska 2009, salah satu hasilnya menunjukkan bahwa polimorfisme gen TNF α alel -308GA berlaku pada populasi Asia saja walaupun hal ini ditolak oleh Teramoto2001, dan disimpulkan tentang pentingnya etnik pada identifikasi genetik PPOK. Universitas Sumatera Utara Data terakhir dari penelitian yang dilakukan Castaldi 2010, suatu metaanalisis terhadap 27 variasi gen pada PPOK dan kesimpulannya ada 4 yang secara signifikan berhubungan dengan kerentanan terjadinya PPOK yaitu GSTM1, rs18000470 TGFB1, rs1799896SOD3 dan rs1800629 TNF α -308 TNFα. Selain itu, sekresi interleukin-1 dan e prostaglandin 2 dari subyek yang berbeda sangatberkorelasi dengan tingkat produksi TNF αMolvig, 1988. Ekspresi TNFα dapat diatur pada tingkat transkripsional Sariban, 1988, dan perbedaan dalam produksi TNF α ditentukan pada tingkat genetik. Telah terbukti dalam studi transfection bahwa alel kurang umum, TNFα , adalah terkait dengan dasar yang lebih tinggi dan menyebabkan ekspresi Wilson, 1992 1994. Hubungan positif dengan polimorfisme gen TNFα juga ditemukan di beberapa penyakit, seperti malaria serebral McGuire, 1994 dan dermatitis herpetiformis Messer, 1994, ankylosing spondilitis Verjans, 1994, artritis rematik Wilsonet, 1995, dan kolitis ulserativa Mansfield, 1994 .

2.3.2 Tek nik pemeriksaan Gen TNFα dengan TehnikPCR dan RFLP