lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selam 15 menit. Kemudian tambahkan 100ul Protein Presipitation Solution, lalu divortex dan sentrifuga
selama 3 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan 600 ul isopropanol untuk mengekstraksi DNA, lalu dicuci dengan alkohol
70. Sentrifuga selama 1 menit, lalu supernatan dibuang, dan pelet DNA dikeringkan dengan menggunakan konsentrator dengan suhu
30ºC selama 15 menit. DNA yang sudah kering dilarutkan dalam 50ul buffer Tris HCL EDTA TE.
3.7.3 Analisis Polimorfisme gen TNFα
Metode PCR-RFLP digunakan untuk melakukan pemeriksaan polimorfisme TNFα -238GA dan -308GA yang akan mengamplifikasi
gen TNFα dengan menggunakan primer spesifik kemudian produk PCRnya didigesti dengan enzim MspI untuk 238 dan enzim NcoI untuk
308 dan hasilnya dielektroforesis dalam gel agarose 2.
PCR-RFLP pada - 308 gen TNFα
Genotip TNFα -308 rs1800629 dianalisis dengan metoda PCR-RFLPPolymeraseChain Reaction-Restriction Fragment Lenght
Polymorphism menggunakan primer untuk amplifikasi gen dengan PCR yaituprimer ATF-3 5’ GTT CCT TGG AAGCCA AGA CT 3’ dan
ATR-1 5’ GTC AGG GGA TGT GGC GTC T 3’ padatahapreaksipertamadan primer ATF-2 5’ TGG AGG CAA TAG
GTT TTG AGGGCC AT 3’ dan ATR-2 5’ TCA TCT GGA GGA AGC CGT A 3’ untukreaksiPCR kedua Turyadi, 2006.
Universitas Sumatera Utara
PCR dilakukan dua tahap dengan menggunakan dua pasang primer ini karena ukuran fragmen yang diharapkan cukup pendek dan
kemungkinan munculnya fragmen yang tidak diharapkan cukup tinggi. Tahapan PCR pertama dimaksudkan untuk meningkatkan jumlah
DNAcetakan pada PCR tahap kedua.Strategi penempatan primer pada proses PCR dibuat berdasarkan data dari GenBank. Salah satu
primer yang digunakan dalam amplifikasi gen -308 TNFα dibuat
dengan merubah salah satu nukleotida untuk menciptakan adanya situs restriksi NcoI pada hasil PCR. Strategi penempatan primer pada
tehnik PCR-RFLP diperlihatkan pada gambar 11. Proses PCR tahap pertama menggunakan pasangan primer ATF-1 dan ATR-1
mengamplifikasi sekuen gen -308 TNFα dengan ukuran 815 pb
pasang basa dimana didalamnya terdapat fragmen yang merupakan target PCR tahap kedua dengan menggunakan primer ATF-2 dan
ATR2 yang akan menghasilkan produk DNA berukuran 231 pb seperti terlihat pada gambar 11.
Gambar 11. Strategi penempatan primer pada proses penggandaan fragmen DNA promoter gen -308
TNFα. Garis di sebelah kiri kotak adalah daerahpromoter dan sebelah kanan adalah intron pertama,
sementara kotakmenandakan daerah ekson.
Universitas Sumatera Utara
Perbanyakan DNA dengan teknik Polymerase Chain Reaction PCR dilakukan menggunakan mesin PCR Perkin Elmer model 9700.
Komposisi dan kondisi PCR dilakukan dengan menggunakan cara yang disarankan oleh Saiki 1989 dengan dilakukan modifikasi.
Volume reaksi PCR adalah 50 μL yang mengandung bahan-bahan sebagai ber
ikut: 10 X larutan dapar 5 μL, MgCl2 50 mM 1,5 μL, dNTP 10mM 1 μL, primer ATF-3 40 pmolμL 0,5 μL, primer ATR-1
40 pmolμL 0,5 μL, sampel DNA hasil isolasi 5 μL dan enzim Polimerase Taq 1 unit. Kondisi siklus PCR pada reaksi tahap pertama
pada amplifikasi fragmen gen TNFα adalah 94
C selama 30 detik, 58
C selama 30 detik dan 72 C selama 1,5 menit sebanyak 30 siklus.
Pada awal reaksi diberikan penambahan waktu denaturasi 94 C
selama 5 menit dan pada akhir reaksi siklus diberikan penambahan waktu elongasi 72
C selama 5 menit. Kondisi siklus PCR pada reaksi tahap kedua amplifikasi gen
TNFα adalah 94 C selama 30 detik, 61
C selama 30 detik dan 72
C selama 1 menit sebanyak 40 siklus dengan penambahan waktu denaturasi pada awal reaksi 94
C selama 5 menit dan penambahan waktu elongasi 72
C selama 5 menit. Komposisi larutan pada reaksi PCR tahap kedua adalah sama dengan reaksi
tahap pertama, kecuali primer yang digunakan adalah ATF-2 dan ATR-2 serta DNA cetakan yang dipakai adalah hasil PCR tahap
pertama sebanyak 1 μL.
Universitas Sumatera Utara
Untuk mengetahui keberhasilan proses PCR, produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa. Dibuat campuran 2 agarosa
dalam larutan TAE, dipanaskan hingga larut dengan baik, ditambahkan larutan ethidium bromida 10 mgmL sebanyak 1 μL untuk
setiap 10 mL campuran agarosa. Campuran gel agarosa dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah dipasang sisir dan dibiarkan
membeku kira-kira 1 jam hingga sisir dapat dibuka dan terbentuk sumur-sumur gel.
Prinsipkerjaelektroforesissecaragarisbesardapatdijelaskanseba gaiberikut.Sampelditempatkanpadasalahsatuujung media berupa gel,
kemudiankeduaujung gel tersebutdiberialiranlistrikselamabeberapa jam sehinggakomponen-
komponenpenyusunsampelakanbergerakmenujukutub yang muatanlistriknyaberlawanandengannya. Kecepatangerakanmobilitas
tiapkomponeniniakanberbeda-bedasesuaidenganukuranmolekulnya. Makin besarukuranmolekul, makinlambatgerakannya.Akibatnya,
dalamsatuanwaktu yang samamolekulberukuranbesarakanmenempuhjarakmigrasi yang
lebihpendekdaripadajarakmigrasimolekulberukurankecil.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 12. Foto elektroforesis hasil PCR fragmen gen -308 TNFα
Keterangan: Fragmen DNA gen TNFα dengan ukuran 231 pb
Sebanyak 5 μL produk PCR tahap kedua dari masing-masing sampel dicampur dengan 2 μL loading buffer kemudian dimasukkan
ke dalam sumur gel. Dalam satu baris sumur disertakan satu sumur untuk tempat DNA penanda. Elektroforesis dijalankan pada voltase
100 Volt ~ 50 mA selama kurang lebih 40 menit. Hasil elektroforesis dilihat di bawah sinar ultra violet UV. Hasil positif PCR gen
TNFα ditandai dengan adanya pita DNA berukuran 231 pb gambar 12.
Untuk menentukan apakah sampel membawa nukleotida A dan atau nukleotida G pada posisi -308 promoter gen
TNFα dilakukan pemotongan DNA produk PCR dengan menggunakan enzim restriksi
NcoI yang mempunyai situs pengenalan 5’- CˇCATGG-3’. Nukleotida G
memunculkan situs pengenalan NcoI 5’-
CˇCATGG-3’ sehingga DNA
akan dipotong oleh enzim restriksi. Sementara nukleotida A tidak memunculkan situs pengenalan untuk enzim NcoI, tetapi urutannya
menjadi 5’-CCATGA-3’ sehingga enzim restriksi tidak mengenali dan
DNA tidak terpotong. Proses RFLP dilakukan dengan menambahkan 1 unit enzim restriksi NcoI
dan 1 μL larutan penyangga NE buffer 4
Universitas Sumatera Utara
pada 5 μL produk PCR dan menambahkan akuades hingga 10 μL kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 2 jam.
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Gambar 13. Foto elektroforesis hasil pemotongan fragmen gen -308 TNFα oleh enzim restriksi NcoI.
Keterangan: 1. DNA penanda 5. heterozigot GA
2. Kontrol fragmen DNA yang tidak dipotong6. alel homozigot GG 3, 4, 7-12. alel -308A homozigot
TNFα Untuk mengetahui terjadinya pemotongan dilakukan elektroforesis
seperti pada visualisasi produk PCR. Pada alel -308A homozigotyang terjadi pemotongan akan menghasilkan 2 pita dengan ukuran 208 pb
dan 231 pb dan pada alel -308Ghomozigotyang tidak terjadi pemotongan maka hanya muncul satu pita dengan ukuran yang sama
dengan ukuran produk PCR yaitu 231 pb. Sementara pada sampel heterozigot, dimana terdapat alel Gdan alel Aterjadi pemotongan
sebagian sehingga akan menghasilkan 3 pita dengan ukuran 231 pb, 208 pb dan 23 pb Tetapi pada elektroforesis pita DNA ukuran 23 pb
tidak terlihat, sehingga untuk membedakan alel cukup dilakukan dengan melihat perbedaan pita DNA ukuran 231 pb yang posisinya
sejajar dengan produk PCR sebelum dilakukan pemotongan dan pita 208 pb
231 pb
Universitas Sumatera Utara
DNA ukuran 208 pb posisinya lebih rendah seperti diperlihatkan pada gambar 13.
PCR-RFLP pada - 238 gen TNFα
Genotip TNFα -238 rs361525, dianalisis dengan metoda PCR-RFLP PolymeraseChain Reaction-Restriction Fragment Lenght
Polymorphism menggunakan primer untuk amplifikasi gen dengan PCR yaituprimer ATC-TNF
α−238GA rs361525, primernyaadalah 5- ATC-TGGAGGAAGCGGTAGTG-3dan
5- GAAGACCCCCCTCGGAACC-3.
Strategi penempatan primer pada proses PCR dibuat berdasarkan data dari GenBank diperlihatkan pada
gambar 13. Proses PCR menggunakan pasangan primer ATC mengamplifikasi s
ekuen gen TNFα dengan ukuran 150 pb pasang basa seperti terlihat pada gambar 14.
Gambar 14. Strategi penempatan primer pada proses penggandaan fragmen DNA promoter gen -238
TNFα. Garis di sebelah kiri kotak adalah daerahpromoter dan sebelah kanan adalah intron pertama,
sementara kotakmenandakan daerah ekson.
Perbanyakan DNA dengan teknik Polymerase Chain Reaction PCR dilakukan menggunakan mesin PCR Perkin Elmer model 9700.
Ekson 1
-238GA ATC1
ATC2 150pb
Universitas Sumatera Utara
Komposisi dan kondisi PCR dilakukan dengan menggunakan cara yang disarankan oleh Ozhan 2010 dengan dilakukan modifikasi.
Volume reaksi PCR adalah 50 μL yang mengandung bahan-bahan
sebagai berikut: 10 X larutan dapar 5 μL, MgCl2 50 mM 1,5 μL, dNTP 10mM 1 μL, primer ATC-1 40 pmolμL 0,5 μL, primer ATC-2
40 pmolμL 0,5 μL, sampel DNA hasil isolasi 5 μL dan enzim Polimerase Taq 1 unit. Kondisi siklus PCR pada amplifikasi fragmen
gen TNFα adalah 94
C selama 30 detik, 58 C selama 30 detik dan
72 C selama 1,5 menit sebanyak 30 siklus. Pada awal reaksi
diberikan penambahan waktu denaturasi 94 C selama 5 menit dan
pada akhir reaksi siklus diberikan penambahan waktu elongasi 72 C
selama 5 menit. Untuk mengetahui keberhasilan proses PCR, produk PCR
dielektroforesis pada gel agarosa. Dibuat campuran 2 agarosa dalam larutan TAE, dipanaskan hingga larut dengan baik,
ditambahkan larutan eth idium bromida 10 mgmL sebanyak 1 μL untuk
setiap 10 mL campuran agarosa. Campuran gel agarosa dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah dipasang sisir dan dibiarkan
membeku kira-kira 1 jam hingga sisir dapat dibuka dan terbentuk sumur-sumur gel.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 15. Foto elektroforesis hasil PCR fragmen gen TNFα
Keterangan: Fragmen DNA gen TNFα dengan ukuran 150 pb
Sebanyak 5 μL produk PCR tahap kedua dari masing-masing sampel dicampur dengan 2 μL loading buffer kemudian dimasukkan
ke dalam sumur gel. Dalam satu baris sumur disertakan satu sumur untuk tempat DNA penanda. Elektroforesis dijalankan pada voltase
100 Volt ~ 50 mA selama kurang lebih 40 menit. Hasil elektroforesis dilihat di bawah sinar ultra violet UV. Hasil positif PCR gen
TNFα ditandai dengan adanya pita DNA berukuran 150 pb gambar 14.
Untuk menentukan apakah sampel membawa nukleotida A dan atau nukleotida G pada posisi -238 promoter gen
TNFα dilakukan pemotongan DNA produk PCR dengan menggunakan enzim restriksi
MspI yang mempunyai situs pengenalan 5’- CˇCGG-3’. Nukleotida G
memunculkan situs pengenalan MspI 5’-
CˇCGG-3’ sehingga DNA
akan dipotong oleh enzim restriksi. Sementara nukleotida A tidak memunculkan situs pengenalan untuk enzim MspI, tetapi urutannya
menjadi 5’-C
ˇCGA-3’ sehingga enzim restriksi tidak mengenali dan
DNA tidak terpotong. Proses RFLP dilakukan dengan menambahkan
500pb 300pb
150pb
Universitas Sumatera Utara
1 unit enzim restriksi MspI dan 1 μL larutan penyangga NE buffer 4
pada 5 μL produk PCR dan menambahkan akuades hingga 10 μL kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 2 jam.
Gambar 16. Foto elektroforesis hasil pemotongan fragmen TNFα oleh
enzim restriksiMspI.Keterangan foto elektroforesis bagian atas: M = DNA penanda
UC = Kontrol fragmen DNA yang tidak dipotong 24,27-32,34-36,38,40-46 = alel -308G homozigot
TNFα 25,26,33,37,39 = heterozigot GA
Untuk mengetahui terjadinya pemotongan dilakukan elektroforesis
seperti pada visualisasi produk PCR. Pada alel -238A homozigottidak terjadi pemotongan hanya muncul 1 pita yang sama dengan ukuran
produk PCR dengan ukuran 150 pb dan pada alel - 238Ghomozigotyang terjadi pemotongan maka akan menghasilkan
500pb 300pb
150pb 130pb
Universitas Sumatera Utara
dua pita dengan ukuran yaitu 130pb dan 20pb. Sementara pada sampel heterozigot, dimana terdapat alel Gdan alel Aterjadi
pemotongan sebagian sehingga akan menghasilkan 3 pita dengan ukuran 150 pb, 130 pb dan 20 pb Tetapi pada elektroforesis pita DNA
ukuran 20 pb tidak terlihat, sehingga untuk membedakan alel cukup dilakukan dengan melihat perbedaan pita DNA ukuran 150 pb yang
posisinya sejajar dengan produk PCR sebelum dilakukan pemotongan dan pita DNA ukuran 130 pb posisinya lebih rendah seperti
diperlihatkan pada gambar 16.
3.8 Bahan dan Alat penelitian