37 perlu, tambahkan lagi pelarut hingga batas permukaan atas ekstrak-celite; dinding
kolom diketuk perlahan-lahan dengan sumbat karet sampai permukaan ekstrak-celite merata. Tambahkan pelarut dengan pipet melalui dinding tabung sampai permukaan
pelarut berada sekitar 5 cm di atas permukaan ekstrak-celite. Sistim pelarut yang digunakan adalah fase gerak landaian dimulai dengan n-heksana 2,5 L n-
heksana:EtOAc dengan perbandingan 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 dan 5:5 masing-masing 1 L dan EtOAc 2,5 L. Tetesan eluat diatur 5 mLmenit dan eluat ditampung dalam wadah botol
atau tabung. Eluat dikelompokkan berdasarkan pola bercak kromatografi lapis tipis KLT, dikeringkan dengan penguap putar. Selanjutnya dilakukan uji bioaktivitas yaitu
uji kematian larva udang BSLT, uji antiproliferasi sel lestari tumor dan uji fagositosis dengan fraksi EtOAc
c. Pemurnian Fraksi Etil Asetat
Fraksi EtOAc yang dimurnikan adalah fraksi EtOAc yang memberikan nilai penghambatan pertumbuhan PP yang tertinggi terhadap sel HeLa, K-562 dan WEHI
164. Pemurnian fraksi EtOAc dilakukan dengan KCKT fase normal menggunakan instrumen Shimadzu LC 6 AD dan 10 AT VP dengan kolom SHIM Pack CLC Sil 4,6
mm x 15 cm, fase gerak n-heksanaEtOAc, detektor UV λ
254 nm dan laju alir 1 mLmenit. Sejumlah tertentu dari fraksi fraksi B dan C hasil fraksinasi kolom ekstrak
EtOAc dilarutkan dalam 10 mL EtOAc dan sebanyak 20 µL larutan contoh disuntikkan pada setiap periode pemisahan KCKT. Penampungan eluat dilakukan
secara manual berdasarkan pemunculan puncak yang diperhatikan interes pada layar monitor. Eluat yang diperoleh kemudian dikeringkan selanjutnya dilakukan uji
bioaktivitas sebagai antiproliferasi dan fagositosis untuk memperoleh fraksi bioaktif. d.
Karakterisasi Kimia
Karakterisasi kimia ditentukan berdasarkan data spektroskopi UV, IM dan massa sebagai bahan kajian untuk mengungkapkan struktur kimia fraksi bioaktif
terpilih. Karakterisasi kimia yang dilakukan meliputi: 1. Spektrometri UV
Data spektrum serapan pada daerah panjang gelombang ultraviolet bermanfaat untuk mengetahui gugus kromofor gugus kovalen tidak jenuh yang bertanggung jawab
38 terhadap serapan elektronik seperti C=C, C=O, NO
2
yang terdapat dalam suatu senyawa Silverstein dan Wester 1995.
Serbuk fraksi B-1 dan C-1 dilarutkan dalam metanol, selanjutnya diukur spektrum serapan maksimum pada panjang gelombang 200 sampai 500 nm.
2. Spektrometri Infra merah Fourier Transform Infra Red Data spektrum infra merah bemanfaat untuk mengetahui jenis gugus fungsi yang
ada dalam molekul senyawa Williams dan Fleming 1985. Sebanyak 1 mg serbuk fraksi B-1 dan C-1 digerus dengan 200 mg kalium bromida
sampai homogen. Selanjutnya serbuk yang telah homogen dimasukkan ke dalam sample pan
untuk dibuat reka man spektrum infra merah pada bilangan gelombang 4000 - 500
cm
-1
. 3. Spektrum Massa
Di dalam spektrometer massa, molekul senyawa ditembak dengan berkas elektron electron impact sebesar 70 ev. Senyawa akan menghasilkan ion molekul dan
fragmentasinya yang dipilah berdasarkan nisbah massa terhadap muatan mz. Dari data spektrum massa suatu senyawa dapat diketahui bobot molekul suatu senyawa
Silverstein dan Wester 1995. Pengukuran massa senyawa fraksi bioaktif dilakukan dengan instrumen Shimadzu LCMS 2010A yaitu instrumen tandem pasangan Liquid
Chromatography LC dan Mass Spectrometer MS. Pada sistem instrumen ini diterapkan sistim kromatografi fase terbalik dengan fase diam yaitu kolom C18
Princeton Omni; 2,0 mm x 15 cm bersifat non polar dibandingkan fase gerak yaitu metanolasam formiat 1:1. Kromatograf ini dilengkapi dengan detektor Photo Diode
Array PDA yang dapat memonitor pada panjang gelombang 100-800 nm dan oven. Volume penyuntikkan larutan contoh adalah 5 µL dan laju alir fase gerak sebesar 0,2
mlmenit.
2. Uji Aktivitas Biologik a.
