42 3. Perhitungan sel lestari tumor pasca perlakuan.
Pada kultur sel monolayer sel HeLa dan WEHI 164 dilakukan tripisinasi untuk melepaskan sel yang menempel pada dasar sumur. Medium penumbuh pada masing-
masing sumur dibuang terlebih dahulu kemudian ditambahkan 40 µL tripsin 0,2 dan diinkubasi selama 8 menit. Pada masing-masing sumur dimasukkan 960 µL mediu m
penumbuh dan dikocok perlahan dengan mikropipet hingga homogen. Sebanyak 90 µL kultur sel dan 10 µL biru tripan dikocok hingga homogen di dalam sumur microplate
96 lubang selanjutnya 10 µL campuran tadi, diteteskan pada celah hemositometer Neubauer untuk menghitung jumlah sel hidup dan mati yang ada dalam 25 kotak pada
bagian tengah kamar hitung. Pada setiap ulangan dibuat 2 preparat untuk dilakukan pembacaan sebanyak 3 kali. Kultur sel K-562 bersifat suspensi sehingga tidak perlu
dilakukan tripisinisasi, kultur sel dikocok homogen dengan mikropipet selanjutnya dibuat pewarnaan dengan prosedur yang sama seperti pada sel HeLa. Parameter yang
dihitung adalah persentase penghambatan pertumbuhan PP berdasarkan perbandingan jumlah total sel dalam sumur microplate kontrol dan perlakuan serta
kadar hambat median IC
50
dari masing-masing fraksi uji. Penghambatan pertumbuhan PP sel tumor dihitung dengan rumus :
Rataan jumlah sel K – Rataan jumlah sel P PP = ---------------------------------------------------------- X 100
Rataan jumlah sel K Keterangan:
K = kelompok kontrol ; P = kelompok perlakuan
c. Uji Fagositosis Makrofag Secara In-vitro
Dilakukan sesuai dengan metode Wagner dan Jurcic 1991 yang telah dimodifikasi bertujuan untuk menilai pengaruh pemberian larutan contoh pada beberapa
tingkat kadar terhadap kemampuan fagositosis sel makrofag; sesuai bagan alur kerja pada Gambar 6.
1. Preparasi makrofag peritoneal mencit Mencit dianastesi dengan kapas yang ditetesi eter, setelah mencit benar-benar
mati, kulit bagian abdomen hingga bagian belakang perut digunting. Membran peritoneum dibersihkan dengan alkohol 70 dan sebanyak 3 mL larutan PBS
43 disuntikkan ke dalam rongga peritoneal. Usap perlahan-lahan abdomen dengan tangan
selama 2-3 menit selanjutnya sedot kembali cairan peritoneal dan masukkan ke dalam tabung steril. Hitung jumlah makrofag yang diperoleh dari cairan peritoneal tersebut
dengan menggunakan hemositometer dan disetarakan sampai diperoleh 10
5
sel makrofagmL.
Gambar 6. Bagan alur uji fagositosis 2. Pembuatan suspensi bakteri Staphyloccocus epidermidis.
Bakteri ditumbuhkan dalam 10 mL THB selama semalam pada suhu 37 C
kemudian disentrifus 3000 rpm selama 30 menit. Pelet yang diperoleh disuspensikan dalam 10 mL PBS dan kekeruhannya disetarakan dengan larutan Mc Farland no.2 yaitu
10
9
colony forming unit CFUmL. Suspensi ini kemudian diencerkan secara bertingkat sebanyak 2 kali hingga setara dengan 10
7
CFUmL. 3. Pengujian fagositosis
Ke dalam tabung reaksi masukkan sebanyak 200 µ
L PBS kontrol atau 200 µ
L larutan contoh dengan kadar tertentu, 200
µ L suspensi makrofag 10
5
mL dan 200 µ
l
Staphylococcus epidermidis
Makrofag peritoneum mencit
Hitung jumlah makrofag aktif per-100 makrofag
Dan jumlah bakteri yang difagosit oleh 50 makrofag
Inkubasi 37 C 60 menit
Tambah 50 µL EDTA 0,02 M Makrofag
~ 10
5
CFU mL
Pewarna Giemsa
S. epidermidis ~ 10
7
CFU mL
C-3 C-2
C-1 B-1
D C
B A
6,25 25,0
12,5 0,00
100 50,0
10 1000
100
Satuan kadar : bpj
44 suspensi bakteri S. epidermidis 10
7
CFUmL, campuran tersebut diaduk homogen dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37
C. Untuk mengakhiri fagositosis ditambahkan larutan 50 µL EDTA 0,02 M. Sebanyak 100 µL campuran inkubasi diteteskan pada
kaca preparat untuk dibuat preparat ulas. Preparat difiksasi dengan metanol selama 15 menit kemudian diwarnai dengan pewarna Giemsa dan dikeringkan selama 30 menit,
pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya 10x100. Parameter yang diamati adalah sel fagosit aktif SFA yaitu jumlah sel makrofag yang aktif melakukan
fagositosis per-100 makrofag dan indeks fagosit IF yaitu jumlah rata-rata bakteri yang ditelan oleh satu makrofag aktif; dihitung dari jumlah total bakteri yang ditelan oleh 50
sel makrofag aktif Wagner dan Jurcic 1991; Ichinose et al. 1998.
SFA kelompok Perlakuan – SFA kelompok Kontrol Stimulasi SFA = ------------------------------------------------------------------ X 100
SFA kelompok Kontrol
IF kelompok Perlakuan – IF kelompok Kontrol Stimulasi IF = ----------------------------------------------------------------- X 100
IF kelompok Kontrol
d. Analisis Jumlah Kromosom
