44 suspensi bakteri S. epidermidis 10
7
CFUmL, campuran tersebut diaduk homogen dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37
C. Untuk mengakhiri fagositosis ditambahkan larutan 50 µL EDTA 0,02 M. Sebanyak 100 µL campuran inkubasi diteteskan pada
kaca preparat untuk dibuat preparat ulas. Preparat difiksasi dengan metanol selama 15 menit kemudian diwarnai dengan pewarna Giemsa dan dikeringkan selama 30 menit,
pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya 10x100. Parameter yang diamati adalah sel fagosit aktif SFA yaitu jumlah sel makrofag yang aktif melakukan
fagositosis per-100 makrofag dan indeks fagosit IF yaitu jumlah rata-rata bakteri yang ditelan oleh satu makrofag aktif; dihitung dari jumlah total bakteri yang ditelan oleh 50
sel makrofag aktif Wagner dan Jurcic 1991; Ichinose et al. 1998.
SFA kelompok Perlakuan – SFA kelompok Kontrol Stimulasi SFA = ------------------------------------------------------------------ X 100
SFA kelompok Kontrol
IF kelompok Perlakuan – IF kelompok Kontrol Stimulasi IF = ----------------------------------------------------------------- X 100
IF kelompok Kontrol
d. Analisis Jumlah Kromosom
Analisis jumlah kromosom sel lestari tumor dilakukan mengikuti metode MacDonald 1998 dengan bagan alur kerja tertera pada Gambar 7.
Ke dalam biakan sel yang ditumbuhkan dalam cawan petri ditambahkan larutan fraksi B-1 dan C-1, masing-masing dengan kadar 1,5 bpj dan diinkubasi 37
C, 5 CO
2
selama 72 jam. Pada akhir masa inkubasi, ditambahkan 100 µL larutan kolkisin 10 bpj dan diinkubasi kembali selama 2-4 jam. Larutan disentrifuse 500 rpm selama 10 menit
untuk memisahkan pelet sel. Kemudian ditambahkan 4 mL KCl 0,075 M dan inkubasi kembali selama 10-20 menit. Pelet sel difiksasi dengan MeOH-asam asetat 3:1 dingin,
kemudian preparat diwarnai dengan pewarna Giemsa. Jumlah kromosom dari 50 sel metafase dihitung dan dibuat grafik histogram berdasarkan indeks ploidi IP yaitu
perbandingan jumlah kromosom kelompok perlakuan dibandingkan dengan jumlah kromosom normal dari spesies asal sel lestari tumor Fabrius et al. 2003.
45
Gambar 7. Bagan alur analisis jumlah kromosom
e. Pewarnaan Sel lestari tumor dengan Pewarna Fluoresens.
Pewarnaan sel lestari tumor dilakukan mengikuti metode Baehrecke dan Mehmet 2003 dengan bagan alur kerja tertera pada Gambar 8.
yang Ke dalam biakan sel yang ditumbuhkan dalam cawan petri ditambahkan larutan fraksi B-1 dan C-1, masing-masing dengan kadar 1,5 bpj dan diinkubasi 37
C, 5 CO
2
selama 48 jam. Pada akhir masa inkubasi 48 jam, media diambil dan pe let sel difiksasi dengan formalin 3,7 PBS dalam suasana dingin. Kemudian ditambahkan
pewarna fluoresens Hoechst 33342 fluorochrome bis-benzimide trihydrochloride di
ruangan gelap. Setelah 15 menit, pengamatan perubahan morfologi dinding dan inti sel dilakukan dengan menggunakan mikroksop fluoresens.
Inkubasi 72 jam, 37
C , 5 CO
2
Pewarnaan Giemsa
0,1 mL Kolkisin 10bpj 2-4 jam37
C 4 mL KCl 0,075 M
10-30 menit37 C
Fiksasi Metanol-asetat 3:1
C-1 B-1
Medium
Wehi K562
HeLa
K- K-
K-
46
Gambar 8. Bagan alur pewarnaan sel tumor dengan pewarna fluoresens
3. Analisis Data
