Ekstrak dan Fraksi EtOAc

59

B. Uji Aktivitas Biologik 1 Uji Kematian Larva Udang BSLT

Pada uji ini diamati tingkat kematian mortalitas larva udang A. salina yang disebabkan oleh ekstrak uji dan dihitung nilai LC 50 lethal concentration yaitu konsentrasi yang menyebabkan kematian sebanyak 50 dari jumlah larva udang dengan menggunakan analisis probit atau metode Finney McLaughlin dan Rogers 1998. Kematian organisme tingkat rendah seperti A. salina dapat digunakan sebagai alat pemandu penapisan dan pencarian bahan bioaktif baru. McLaughlin dan Rogers 1998 mengemukakan bahwa ada hubungan yang positif antara uji toksisitas larva udang dan uji sitotoksistas sel 9KB human nasopharyngeal carcinoma dan uji ini telah digunakan sebagai uji awal prescreen pada Laboratory of the Purdue Cancer Center. Pada penelitian ini diperoleh nilai LC 50 sebesar: 99,33 bpj ekstrak EtOAc, 27,73 bpj fraksi A, 17,68 bpj fraksi B, 13,94 bpj fraksi C, 31,89 bpj fraksi D dan 73,15 bpj fraksi E. Sesuai dengan kriteria Meyer et al. 1982, semua ekstrak fraksi yang diuji ini, termasuk kelompok ekstrakfraksi yang aktif dengan nilai LC 50 1000 bpj sedangkan nilai LC 50 yang bervariasi, menggambarkan distribusi kandungan kimia dalam masing-masing fraksi uji.

2. Uji Aktivitas Antiproliferasi

a. Ekstrak dan Fraksi EtOAc

Pada uji antiproliferasi ini dilakukan penghitungan jumlah sel tumor secara langsung dengan metode pewarnaan biru tripan menggunakan kamar hitung hemositometer. Pada Gambar 19 terlihat sel mati panah besar menyerap warna biru tripan dan sel hidup panah kecil berwarna bening. Sel mati akan kehilangan integritas membran sehingga mudah menyerap zat warna biru tripan dan menghasilkan warna biru. Metode lain untuk menghitung jumlah sel secara tidak langsung adalah metode pewarnaan dengan MTT [3-4,5,-dimethylthiazol-2-yl-2,5 diphenyl-tetrazolium bromide]. Ensim suksinat dehidrogenase dari mitokondria sel hidup akan mereduksi garam tetrazolium dan membentuk kristal formazan berwarna biru yang dapat diukur intensitas warnanya dengan spektrofotometer Zachary 2003. 60 Gambar 19. Sel WEHI 164 dengan pewarnaan biru tripan pada kamar hitung hemositometer. Sel mati panah besar dan sel hidup panah kecil. 25 32 27 29 6 25 53 55 21 33 30 41 43 49 18 20 30 19 10 20 30 40 50 60 70 B15 C15 A30 D30 E75 EtOAC 100 PP HeLa K-562 WeHi Gambar 20. Persentase penghambatan pertumbuhan sel tumor oleh fraksi EtOAc Pada penelitian ini diperoleh persentase penghambatan pertumbuhan PP sel HeLa, K-562 dan WEHI 164 dengan perlakuan ekstrak EtOAc dan fraksi EtOAc fraksi A,B,C,D,E bervariasi 5,8 - 54,9 Gambar 20. Ekstrak EtOAc 100 bpj menghambat pertumbuhan sel HeLa 25,0, sel K-562 41,3 dan sel WEHI 164 19,2. Potensi penghambatan ekstrak EtOAC terhadap ketiga jenis sel lestari tumor ini lebih rendah bila dibandingkan potensi penghambatan ekstrak hasil penyarian rimpang temu putih dengan pelarut yang berbeda EtOH dan CHCl 3 yang diujikan pada sel mieloma dan karsinoma Priosoeryanto et al. 2001 diperoleh potensi penghambatan pertumbuhan 61 dari ekstrak CHCl 3 30 bpj sebesar 86,6 sel mieloma dan 78,4 sel karsinoma; ekstrak EtOH 90 bpj sebesar 83,7 sel mieloma dan 80,8 sel karsinoma. Etanol adalah pelarut yang serba guna dan melarutkan senyawa yang bersifat polar seperti glikosida, flavonoid, steroid, kurkumin, kumarin, damar, klorofil Harbone 1987. Pada umumnya kepolaran senyawa organik meningkat dengan bertambahnya gugus fungsi dan menurun dengan bertambahnya atom karbon Gritter et al. 1991. Salah satu faktor yang menentukan besarnya jumlah komponen aktif yang tersari dalam cairan pelarut adalah sifat kelarutan komponen tersebut dalam pelarut yang digunakan. Rusmarilin 2004 melaporkan bahwa kadar 1-asetoxy chavicol acetate ACA yang diperoleh dari hasil ekstraksi rimpang lengkuas merah Alpinia galanga, suku Zingiberaceae dengan pelarut EtOAc memberikan kadar ACA dan potensi penghambatan pertumbuhan sel tumor A549, K-562, A 375 dan HeLa yang lebih tinggi dibandingkan dengan pelarut kloroform, etanol dan air. Komponen kimia fraksi EtOAc adalah golongan terpenoid dan flavonoid yang terdistribusi di dalam fraksi A,B,C,D,E dengan kadar yang bervariasi. Di dalam tumbuhan, kelompok senyawa terpenoid dan flavonoid terdapat dalam bentuk glikosida sehingga lebih mudah larut air. Sebagian besar bentuk aglikon terpenoid adalah non polar, karena itu dapat dipisahkan dengan pelarut non polar. Pada penelitian ini diperoleh data PP kultur sel HeLa sebesar 5,8 fraksi E sedangkan ekstrak EtOAC dan fraksi A,B,C,D memberikan nilai PP sebesar 25,0 - 32,0 yang tidak berbeda nyata P0,05 diantara kelompok perlakuan bila dianalisis dengan uji jarak berganda Duncan Lampiran 6. Semakin kecil kadar yang dibutuhkan untuk menghasilkan suatu respon PP, maka semakin potensial fraksi uji tersebut. Potensi PP kultur sel HeLa oleh fraksi B dan C 15 bpj adalah 2 kali lebih besar dari fraksi A dan D 30 bpj dan 6,6 kali lebih besar dibandingkan ekstrak EtOAC 100 bpj. Potensi PP sel HeLa oleh ekstrak EtOAc 200 bpj rimpang lengkuas merah 84,4 Rusmarilin 2004 lebih besar bila dibandingkan dengan ekstrak EtOAc 100 bpj rimpang temu putih 25 . Penghambatan pertumbuhan sel K-562 dan sel WEHI 164 paling tinggi diperoleh pada kelompok perlakuan dengan fraksi B dan C sebesar 42,5 – 54,9 Gambar 20. Menurut Suffness dan Pezzuto 1991; fraksi B dan C 15 bpj termasuk ke dalam kelompok fraksi aktif dengan nilai PP sel tumor sekitar 50 pada kadar 20 bpj. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa fraksi B dan C yang diperoleh 62 dari fraksinasi ekstrak EtOAc mempunyai aktivitas yang baik terhadap PP ketiga sel tumor, sehingga pada kedua fraksi ini dilakukan pemurnian dengan KCKT.

b. Fraksi Bioaktif