Uji Antiproliferasi Sel Lestari Tumor Secara In-vitro

40

b. Uji Antiproliferasi Sel Lestari Tumor Secara In-vitro

Uji antiproliferasi sel tumor lestari HeLa, K -562 dan WEHI 164 secara in-vitro dilakukan menurut metode yang diuraikan oleh Priosoeryanto et al. 1995 seperti yang tertera pada bagan alur Gambar 5. 1. Persiapan media dan kultur sel tumor Media yang digunakan untuk pertumbuhan kultur sel tumor adalah media DMEM Dubelcco’s Minimal Essential Media . Bubuk media dilarutkan dalam 50 mL akuabides steril dengan bantuan stirer sampai semua media terlarut. Selanjutnya ditambahkan 2,438 g NaHCO 3 sambil terus diaduk dengan stirer. Volume media ditepatkan sampai 1000 mL dan disterilkan dengan menggunakan filter membran 0,2 µm. Media ini digunakan untuk membuat larutan stok contoh maupun media pencuci sedangkan media lengkap untuk pertumbuhan kultur sel ditambahkan dengan 10 FBS Fetal Bovine Serum, 100 IUmL antibiotika penisilin -streptomisin dan 0,01 anti jamur fungison. Pada penyimpanan jangka panjang sel lestari tumor disimpan dalam tabung nitrogen cair pada suhu minus 190 C. Untuk mengkultur kembali sel beku dari tabung nitogen cair, vial yang berisi sel lestari tumor ditiriskan thawing terlebih dahulu pada suhu 37 C sampai sebagian media sel meleleh. Bagian luar vial dibersihkan dengan alkohol 70 untuk menghindari kontaminasi kemudian pindahkan isi vial ke dalam tabung sentrifus 15 mL secara aseptik di dalam laminar air flow. Tambahkan media pencuci ke dalam vial untuk membilas sel yang masih tertinggal dan volume suspensi sel ditepatkan sampai 10 mL. Sentrifus suspensi sel dengan kecepatan 1000 rpm pada suhu 4 C selama 5-10 menit. Supernatan dibuang kemudian pada pelet sel ditambah media pencuci sampai 10 mL dan ulangi sentrifus dengan kecepatan dan waktu yang sama. Supernatan kembali dibuang dan pelet sel dilarutkan dalam 5 mL media lengkap dan diaduk perlahan agar suspensi sel homogen. Untuk menghitung jumlah sel awal viabilitas sel, maka sebanyak 10 µL suspensi sel dicampur secara merata dengan 10 µL biru tripan, sebanyak 10 µL campuran ini ditetesi pada celah hemositometer kemudian ditutup dengan gelas penutup dan hitung jumlah sel dengan mikroskop cahaya perbesaran 100 kali dalam 25 kotak pada bagian tengah kamar hitung. Sel mati akan menyerap warna biru tripan sedangkan sel hidup tidak menyerap warna dan kelihatan bening. Jumlah sel mL = rata -rata jumlah sel x faktor pengenceran x faktor konversi. 41 Faktor pengenceran = 2; diperoleh dari 10 µL suspensi sel + 10 µL biru tripan . Faktor konversi untuk hemositometer Neubauer tinggi celah 0,1 mm = 10 4 Pemeliharaan sel dilakukan dalam media lengkap yaitu dengan mengganti dan mencuci kultur sel setiap 3 hari atau bila warna media telah berubah dari merah menjadi oranyekuning yang menandakan terjadinya penurunan pH; beberapa sel akan mati bila terjadi penurunan pH sampai 6,0 Freshney 1992. Gambar 5. Bagan alur uji antiproliferasi 2. Pengujian antiproliferasi Kadar uji untuk Ekstrak EtOAc dan fraksi A,B,C,D,E disesuaikan dengan hasil uji kematian larva udang BSLT, sedangkan kadar uji masing-masing fraksi B-1, C- 1,C-2 dan C-3 adalah 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 dan 8,0 bpj. Masukkan ke dalam masing-masing sumur microplate 24 lubang 20 µL suspensi sel lestari tumor 2-5 x 10 4 mL, 20 µL larutan contoh dengan kadar tertentu dan 960 µL medium lengkap; masing-masing perlakuan dilakukan 3 kali ulangan. Kultur sel diinkubasi dalam inkubator 37 C, 5 CO 2 , RH 90 selama 72-96 jam tergantung pada jenis sel atau sampai pertumbuhan sel confluence. K-562 HeLa WeHi Inkubasi 72 jam, 37 C , 5 CO 2 Pewarnaan Biru tripan 0,5 1,0 2,0 K- 4,0 8,0 0,5 1,0 2,0 K- 4,0 8,0 0,5 1,0 2,0 K- 4,0 8,0 A B C K- D E A B C K- D E A B C K- D E Et OA Et OA EtA C C-3 C-2 C-1 B-1 D C B A Et E Satuan kadar: bpj 42 3. Perhitungan sel lestari tumor pasca perlakuan. Pada kultur sel monolayer sel HeLa dan WEHI 164 dilakukan tripisinasi untuk melepaskan sel yang menempel pada dasar sumur. Medium penumbuh pada masing- masing sumur dibuang terlebih dahulu kemudian ditambahkan 40 µL tripsin 0,2 dan diinkubasi selama 8 menit. Pada masing-masing sumur dimasukkan 960 µL mediu m penumbuh dan dikocok perlahan dengan mikropipet hingga homogen. Sebanyak 90 µL kultur sel dan 10 µL biru tripan dikocok hingga homogen di dalam sumur microplate 96 lubang selanjutnya 10 µL campuran tadi, diteteskan pada celah hemositometer Neubauer untuk menghitung jumlah sel hidup dan mati yang ada dalam 25 kotak pada bagian tengah kamar hitung. Pada setiap ulangan dibuat 2 preparat untuk dilakukan pembacaan sebanyak 3 kali. Kultur sel K-562 bersifat suspensi sehingga tidak perlu dilakukan tripisinisasi, kultur sel dikocok homogen dengan mikropipet selanjutnya dibuat pewarnaan dengan prosedur yang sama seperti pada sel HeLa. Parameter yang dihitung adalah persentase penghambatan pertumbuhan PP berdasarkan perbandingan jumlah total sel dalam sumur microplate kontrol dan perlakuan serta kadar hambat median IC 50 dari masing-masing fraksi uji. Penghambatan pertumbuhan PP sel tumor dihitung dengan rumus : Rataan jumlah sel K – Rataan jumlah sel P PP = ---------------------------------------------------------- X 100 Rataan jumlah sel K Keterangan: K = kelompok kontrol ; P = kelompok perlakuan

c. Uji Fagositosis Makrofag Secara In-vitro