26 Sebanyak 18.17 g Tris base dan 4 mL 10 SDS dilarutkan dalam 40 mL akuades. Larutan
dibuat pada pH 8.8 dengan 1 N HCl dan ditepatkan dengan akuades hingga volume total 100 mL. Kemudian larutan disaring dengan filter 0.45 µm.
3.2.2.3.1.3 Larutan C 4x Tris-ClSDS, pH 6.8, 100 mL
Sebanyak 6.05 g Tris base dan 4 mL 10 SDS dilarutkan dalam 40 mL akuades. Larutan dibuat pada pH 6.8 dengan 1 N HCl. Dan ditepatkan dengan akuades hingga volume total 100 mL.
Kemudian larutan disaring dengan filter 0.45 µm.
3.2.2.3.1.4 10 ammonium persulfat APS, 0.5 mL
APS 10 dibuat segar setiap kali akan melakukan elektroforesis yaitu dengan melarutkan 0.05 g amonium persulfat dalam 0.5 mL akuades.
3.2.2.3.1.5 5x SDS buffer elektroforesis, 1 L
Sebanyak 15.1 g tris base, 72.0 g glisin, dan 5.0 g SDS dilarutkan dalam 800 mL akuades. Setelah larut, volume ditepatkan hingga 1.0 L. Untuk membuat 1x SDSbuffer elektroforesis, 1 bagian
volume larutan di atas diencerkan dalam 4 bagian volume akuades.
3.2.2.3.1.6 2x SDSbuffer sampel, 100 mL
Sebanyak 30 mL 10SDS, 10 mL gliserol, 5.0 mL 2-merkaptoetanol, 12.5 mL 4x Tris- ClSDS, pH 6.8 dan 5-10 mg bromphenol blue dilarutkan dalam akuades dan ditepatkan volume
hingga 100 mL. Buffer disimpan pada suhu rendah.
3.2.2.3.1.7 Larutan pewarna
staining
Sebanyak 1 gram coomasie brilliant blue R-250, 450 mL metanol, dan 100 mL asam asetat glasial dilarutkan dalam 450 mL akuades.
3.2.2.3.1.8 Larutan penghilang warna
destaining
Sebanyak 100 mL metanol, 100 mL asam asetat glasial dilarutkan dalam 800 mL akuades.
3.2.2.3.2 Pembuatan
Separating Gel
Dua lempengan kaca mini slab yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 mL larutan A dipipet ke dalam gelas piala, kemudian
ditambahkan 2.5 mL larutan B dan 3.5 mL akua-biodestilat. Campuran kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 50 µL APS 10 dan 5 µL TEMED
27 ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke
dalam lempengan kaca mini slab tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk
meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Komposisi separating gel dapat dilihat pada Tabel 8.
Tabel 8. Komposisi separating gel untuk dua plat
Bahan Konsentrasi Akhir Poliakrilamid
5 10
15 20
Larutan A 2500 µL
5000 µL 7500 µL
10000 µL Larutan B
3750 µL 3750 µL
3750 µL 3750 µL
Akuades 8750 µL
6250 µL 3750 µL
1250 µL APS 10
50 µL 50 µL
50 µL 50 µL
TEMED 10 µL
10 µL 10 µL
10 µL
3.2.2.3.3 Pembuatan
Stacking Gel
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tissue. Larutan A, C, dan akuades dicampur dalam gelas piala. TEMED dan APS 10 ditambahkan sambil terus diaduk
dengan magnetic stirrer. Larutan gel dipipet ke dalam mini slab di atas separating gel sampai mencapai puncak plat. Kemudian sisir dimasukkan dengan cepat untuk menghindari pembentukan gel
sebelum sisir dimasukkan. Pemasukan sisir harus dilakukan dengan hati-hati agar udara tidak terperangkap. Stacking gel dibiarkan berpolimerisasi selama 30 menit. Komposisi stacking gel dapat
dilihat pada Tabel 9.
Tabel 9. Komposisi stacking gel untuk dua plat
Bahan Gel 5
Larutan A 650 µL
Larutan C 1250 µL
Akuades 3050 µL
TEMED 5 µL
APS 10 25 µL
3.2.2.3.4 Preparasi dan Pemasukan Sampel Pembuatan Separating Gel
