Penentuan Berat Molekul Protein yang Terpisahkan Pengukuran Tebal Pita Protein Terelektroforesis

28 Sampel berupa curd endapan protein dilarutkan dalam 50 sampai 100 µL 2 x SDS buffer sampel di dalam tabung Eppendorf, kemudian dipanaskan selama 1 menit dalam air mendidih 100 o C. Setelah pemanasan, dinginkan pada suhu ruang dan sentrifusa dengan kecepatan rendah selama 5 menit. Sampel siap dimasukkan ke dalam pelat gel.

3.2.2.3.5 Running Elektroforesis Pemisahan Protein

Reservoir buffer bawah diisi dengan buffer elektroforesis. Sisir dari slab dilepaskan, kemudian slab direkatkan pada chamber elektroforesis. Reservoir atas kemudian diisi dengan buffer elektroforesis. Sumur-sumur pada gel diatur agar tidak ada gelembung air yang terdapat di dalamnya, kemudian sampel dimasukkan pada masing-masing sumur. Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 125 V. Running dilakukan selama 30-40 menit sampai migrasi dye sekitar 1 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda.

3.2.2.3.6 Pewarnaan Gel

Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah yang telah berisi pewarna coomassie brilliant blue. Kemudian diagitasi dalam rotary shaker selama 5-10 menit. Larutan stain dibuang dan diganti dengan larutan penghilang warna destain.

3.2.2.3.7 Destaining Gel Penghilangan Warna

Setelah larutan stain dibuang, ditambahkan larutan penghilang warna larutan destaining. Penghilangan warna dilakukan dengan merendam gel dalam larutam destaining selama 30 menit, lalu membilasnya dan mengulang perendaman yang serupa sebanyak 3 kali 2 dengan larutan destaining yang baru. Setelah itu pita-pita protein sudah mulai nampak, namun latar gel belum bersih dari larutan pewarna. Maka gel kembali direndam larutan destaining semalaman. Kemudian gel ditiriskan dan gel siap dianalisis. Semua larutan destaining bekas penghilangan warna dibuang dan tidak bisa dipakai ulang.

3.2.2.3.8 Penentuan Berat Molekul Protein yang Terpisahkan

Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker penanda protein dengan log dari berat molekul marker yang telah diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein yang dibandingkan dengan jarak migrasi tracking dye. Pengukuran mobilitas relatif sesuai dengan Persamaan 3.4. 2 Metode Bolag-Eldestein 1991 menyarankan pencucicanpenghilangan warna dilakukan dalam rotary shaker selama 1 malam. Hal tersebut dilakukan karena keterbatasan alat analisis dalam lab 29 A= BCDCE FGHDCIG JDKLMGN BCDCE FGHDCIG 42 O670 PQ5 3.4

3.2.2.3.9 Pengukuran Tebal Pita Protein Terelektroforesis

Pengukuran ini dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Image J. Program membaca tebal pita per kolom yang dipilih sebagai kurva yang berfluktuasi. Semakin banyak pita yang terbaca, semakin banyak puncak kurva. Tinggi dan lebar kurva dipengaruhi oleh ketebalan dan intensitas pita. Semakin tebal pita, semakin lebar kurva, dan semakin tinggi intensitas warna pita, semikin tinggi puncak pita. Pengukuran dilakukan dengan membandingkan posisi puncak protein sampel dengan posisi puncak protein standar untuk memperoleh jenis protein yang sama. Konsentrasi protein sampel diperolah dengan pengukuran luas kurva di bawah puncak samapi batas dasar. Batas dasar merupakan satu buah garis lurus yang ditaik dan memotong satu gambar keseluruhan, sehingga diperoleh beberapa kurva utama sesuai dengan jumlah protein standar yang dibandingkan.

3.2.3 Tahap III

3.2.3.1 Seleksi Panelis Terlatih

Seleksi dilakukan untuk mendapatkan 12 orang panelis terlatih, yaitu panelis yang mengerti prinsip uji organoleptik dan telah dilatih oleh analis untuk melakukan uji organoleptik tekstur tahu. Penggunaan panelis terlatih dapat memperkecil standar deviasi data subjektif tekstur tahu. Seleksi dilakukan dengan uji penekanan sampel tahu untuk mengukur parameter kekerasan tahu. Seleksi terdiri dari uji segitiga dan uji ranking. Setiap panelis umum mendapat 3 set pengujian. Setiap set terdiri dari 1 uji segitiga dan 1 uji ranking. Panelis yang lolos seleksi adalah panelis yang minimal menjawab dengan benar 2 dari 3 pengujian. Di setiap pengujian, panelis disajikan sampel tahu segar yang dipotong ukuran 1 x 1 x 1 cm 3 . Sampel disajikan pada suhu ruang segera setelah tahu dipotong. Panelis melakukan pengujian di booth yang terpisah. Penilaian dilakukan dengan menekan tahu, mengapitnya dengan ujung ibu jari dan telunjuk di sisi vertikal tahu, tanpa mengangkat potongan tahu. Panelis hanya menilai atribut kekerasan, tanpa dipengaruhi oleh atribut sensori lain.

3.2.3.1.1 Uji Segitiga

Panelis disajikan 3 potong tahu yang terdiri atas 2 sampel sama dan 1 sampel beda dari segi atribut tekstur. Panelis melakukan pengujian tekstur. Kemudian, di antara ketiga tahu tersebut, panelis harus menentukan 1 tahu yang berbeda, dan mengisinya di lembar jawaban, seperti yang terdapat pada Lampiran 1.

3.2.3.1.2 Uji Ranking

Panelis disajikan 3 potong tahu yang terdiri atas 3 sampel berbeda dari segi atribut tekstur. Panelis melakukan pengujian tekstur. Kemudian, mengurutkan ketiga tahu tersebut dari yang terkeras