27 ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke
dalam lempengan kaca mini slab tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk
meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Komposisi separating gel dapat dilihat pada Tabel 8.
Tabel 8. Komposisi separating gel untuk dua plat
Bahan Konsentrasi Akhir Poliakrilamid
5 10
15 20
Larutan A 2500 µL
5000 µL 7500 µL
10000 µL Larutan B
3750 µL 3750 µL
3750 µL 3750 µL
Akuades 8750 µL
6250 µL 3750 µL
1250 µL APS 10
50 µL 50 µL
50 µL 50 µL
TEMED 10 µL
10 µL 10 µL
10 µL
3.2.2.3.3 Pembuatan
Stacking Gel
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tissue. Larutan A, C, dan akuades dicampur dalam gelas piala. TEMED dan APS 10 ditambahkan sambil terus diaduk
dengan magnetic stirrer. Larutan gel dipipet ke dalam mini slab di atas separating gel sampai mencapai puncak plat. Kemudian sisir dimasukkan dengan cepat untuk menghindari pembentukan gel
sebelum sisir dimasukkan. Pemasukan sisir harus dilakukan dengan hati-hati agar udara tidak terperangkap. Stacking gel dibiarkan berpolimerisasi selama 30 menit. Komposisi stacking gel dapat
dilihat pada Tabel 9.
Tabel 9. Komposisi stacking gel untuk dua plat
Bahan Gel 5
Larutan A 650 µL
Larutan C 1250 µL
Akuades 3050 µL
TEMED 5 µL
APS 10 25 µL
3.2.2.3.4 Preparasi dan Pemasukan Sampel Pembuatan Separating Gel
28 Sampel berupa curd endapan protein dilarutkan dalam 50 sampai 100 µL 2 x SDS buffer
sampel di dalam tabung Eppendorf, kemudian dipanaskan selama 1 menit dalam air mendidih 100
o
C. Setelah pemanasan, dinginkan pada suhu ruang dan sentrifusa dengan kecepatan rendah selama 5
menit. Sampel siap dimasukkan ke dalam pelat gel.
3.2.2.3.5 Running Elektroforesis Pemisahan Protein
Reservoir buffer bawah diisi dengan buffer elektroforesis. Sisir dari slab dilepaskan, kemudian slab direkatkan pada chamber elektroforesis. Reservoir atas kemudian diisi dengan buffer
elektroforesis. Sumur-sumur pada gel diatur agar tidak ada gelembung air yang terdapat di dalamnya, kemudian sampel dimasukkan pada masing-masing sumur. Katup elektroda dipasang dengan arus
mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 125 V. Running dilakukan selama 30-40 menit sampai migrasi dye sekitar 1 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik
dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda.
3.2.2.3.6 Pewarnaan Gel
Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah yang telah berisi pewarna coomassie brilliant blue. Kemudian diagitasi dalam rotary shaker selama 5-10 menit. Larutan stain dibuang dan
diganti dengan larutan penghilang warna destain.
3.2.2.3.7 Destaining Gel Penghilangan Warna
Setelah larutan stain dibuang, ditambahkan larutan penghilang warna larutan destaining. Penghilangan warna dilakukan dengan merendam gel dalam larutam destaining selama 30 menit, lalu
membilasnya dan mengulang perendaman yang serupa sebanyak 3 kali
2
dengan larutan destaining yang baru. Setelah itu pita-pita protein sudah mulai nampak, namun latar gel belum bersih dari
larutan pewarna. Maka gel kembali direndam larutan destaining semalaman. Kemudian gel ditiriskan dan gel siap dianalisis. Semua larutan destaining bekas penghilangan warna dibuang dan tidak bisa
dipakai ulang.
3.2.2.3.8 Penentuan Berat Molekul Protein yang Terpisahkan