25 Sejumlah sampel 100-250 mg ditimbang ke dalam labu Kjeldahl. Kemudian ditambahkan
1.9±0.1 g K
2
SO
4
, 40±10 mg HgO dan 2±0.1 mL H
2
SO
4
. Sampel dididihkan selama 1-1.5 jam dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan menjadi jernih, lalu didinginkan. Sejumlah kecil
akuades diteteskan perlahan lewat dinding labu kemudian labu digoyang pelan agar kristal yang terbentuk larut kembali. Isi labu kemudian dipindahkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas 5-6
kali dengan 1-2 mL akuades. Lalu ditambahkan 8-10 mL larutan 60 NaOH-5 Na
2
S
2
O
3
ke dalam alat destilasi. Erlenmeyer berisi 5 mL H
3
BO
3
dan 2 tetes indikator metilen red-metilen blue diletakkan di bawah kondensor dengan kondisi ujung kondensor terendam di bawah larutan H
3
BO
3
. Destilasi dilakukan hingga diperoleh destilat sebanyak ± 15 mL. Destilat yang diperoleh selanjutnya
diencerkan hingga ± 50 mL dan dititrasi dengan HCl terstandar sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu keunguan. Perhitungan kadar protein sesuai dengan Persamaan 3.2 dan 3.3.
14.007 100
3.2
+,- .
0 1234567 899 0 : 7 ; :
= ,+ +.?-
3.3
3.2.2.3 Elektroforesis Protein Terekstraksi Bolag -Edelstein 1991
Elektroforesis SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE dilakukan dengan metode Bolag dan Edelstein 1991, untuk menentukan berat molekul protein yang mempengaruhi
tekstur curd yang terbentuk. Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel 12 dan stacking gel 5. Sampel yang dielektroforesis adalah supernatan
protein hasil ekstraksi dari sampel curd kedelai. Beberapa tahapan utama yang harus dilakukan dalam melakukan elektroforesis SDS-PAGE adalah 1 pembuatan separating gel, 2 pembuatan stacking gel,
3 persiapan sampel, 4 running gel, 5 pewarnaan gel, 6 destaining gel, dan 7 penentuan berat molekul protein-protein yang terpisahkan.
3.2.2.3.1 Pembuatan Larutan
Stok
Larutan stok yang dibuat terdiri atas larutan A, larutan B, larutan C, larutan APS, buffer elektroforesis, buffer sampel, larutan pewarna, dan larutan penghilang warna.
3.2.2.3.1.1 Larutan A Akrilamid 30; 0.8 bisakrilamid, 100 mL
Sebanyak 30.0 g akrilamid dan 0.8 g N,N’-metilen-biasakrilamid dilarutkan dalam 100 mL akuades. Larutan disaring melalui filter 0.45 µm. Pada waktu penimbangan dan selama proses
pelarutan, analis selalu harus menggunakan sarung tangan dan tutup wadah dengan parafilm. Larutan akrilamid dapat disimpan selama 1 bulan dalam lemari pendingin bersuhu 4
o
C.
3.2.2.3.1.2 Larutan B 4x Tris-ClSDS, pH 8.8, 100 mL
26 Sebanyak 18.17 g Tris base dan 4 mL 10 SDS dilarutkan dalam 40 mL akuades. Larutan
dibuat pada pH 8.8 dengan 1 N HCl dan ditepatkan dengan akuades hingga volume total 100 mL. Kemudian larutan disaring dengan filter 0.45 µm.
3.2.2.3.1.3 Larutan C 4x Tris-ClSDS, pH 6.8, 100 mL
Sebanyak 6.05 g Tris base dan 4 mL 10 SDS dilarutkan dalam 40 mL akuades. Larutan dibuat pada pH 6.8 dengan 1 N HCl. Dan ditepatkan dengan akuades hingga volume total 100 mL.
Kemudian larutan disaring dengan filter 0.45 µm.
3.2.2.3.1.4 10 ammonium persulfat APS, 0.5 mL
APS 10 dibuat segar setiap kali akan melakukan elektroforesis yaitu dengan melarutkan 0.05 g amonium persulfat dalam 0.5 mL akuades.
3.2.2.3.1.5 5x SDS buffer elektroforesis, 1 L
Sebanyak 15.1 g tris base, 72.0 g glisin, dan 5.0 g SDS dilarutkan dalam 800 mL akuades. Setelah larut, volume ditepatkan hingga 1.0 L. Untuk membuat 1x SDSbuffer elektroforesis, 1 bagian
volume larutan di atas diencerkan dalam 4 bagian volume akuades.
3.2.2.3.1.6 2x SDSbuffer sampel, 100 mL
Sebanyak 30 mL 10SDS, 10 mL gliserol, 5.0 mL 2-merkaptoetanol, 12.5 mL 4x Tris- ClSDS, pH 6.8 dan 5-10 mg bromphenol blue dilarutkan dalam akuades dan ditepatkan volume
hingga 100 mL. Buffer disimpan pada suhu rendah.
3.2.2.3.1.7 Larutan pewarna
