14 air yang tinggi, secara visual akan memberikan penampakan yang lembut sedangkan tahu dengan
kandungan air yang rendah cenderung memiliki penampakan yang kasar. Kualitas pembentukan tahu dipengaruhi oleh banyak faktor, yaitu mutu kedelai, kondisi pengadukan, koagulan serta penekanan
yang diberikan pada curd. Blazek 2008 menambahkan bahwa perbedaan penggunaan jenis dan konsentrasi koagulan, pengadukan yang dilakukan selama koagulasi, dan tekanan terhadap curd akan
memberikan variasi tahu mulai dari keras hingga lunak dengan kandungan air berkisar antara 70 hingga 90 dan kandungan protein 5 hingga 16 berdasarkan berat basah.
2.5 TEKNIK ELEKTROFORESIS DALAM ANALISIS PROTEIN
Elektroforesis adalah suatu metode pemisahan fraksi-fraksi suatu zat dengan adanya migrasi partikel bermuatan atau ion-ion makromolekul di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi partikel
bermuatan tersebut dapat terjadi karena perbedaan muatan total, ukuran, dan bentuk Pomeranz Meloan 1994. Menurut Rybicky Purves 1996, tingkat migrasi partikel dipengaruhi oleh muatan
total, ukuran partikel, kekuatan ionik, viskositas, dan suhu medium. Teknik elektroforesis telah banyak digunakan dalam analisis protein untuk menentukan tingkat kemurnian sampel, berat molekul,
maupun titik isoelektrik Copeland 1994. Selain itu, teknik ini juga sering digunakan untuk menentukan komposisi protein dari suatu produk pangan. Contohnya adalah dalam penentuan
komposisi konsentrat protein kedelai dan konsentrat protein whey Nielsen 2003. Molekul protein memiliki gugus fungsi yang dapat berionisasi dalam larutan sebagai kation
muatan positif ataupun anion muatan negatif. Jenis muatan dipengaruhi oleh derajat keasaman pH larutan. Jika partikel bermuatan ini ditempatkan dalam medan listrik, akan terjadi migrasi
pertikel baik ke katoda maupun anoda, tergantung muatan alaminya. Migrasi ini pun dapat dihambat oleh gaya gesek partikel itu sendiri terhadap gel. Gaya gesek tersebut dipengaruhi oleh ukuran
molekul, bentuk molekul, ukuran pori medium, dan viskositas buffer Wilson Walker 2000. Di samping itu, besarnya muatan protein dan gradien potensial juga akan menentukan jarak migrasi yang
dilakukan oleh molekul protein dalam medan listrik Nielsen 2003. Salah satu teknik elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis protein adalah teknik
elektroforesis zonal. Dengan teknik ini, protein dipisahkan dari campuran kompleksnya menjadi pita melalui migrasi dalam matriks polimer padat yang disebut gel gel tersebut direndam di dalam larutan
buffer. Gel poliakrilamid merupakan gel yang paling umum digunakan pada teknik pemisahan protein secara elektroforesis zonal Nielsen 2003.
Gel poliakrilamid dibentuk dari polimerisasi akrilamid dengan sejumlah kecil metilen- bisakrilamid yang bertindak sebagai cross-linking agent, dan diinisiasi oleh tetrametil-etilendiamin
TEMED dan amonium persulfat APS Wilson Walker 2000. Spesies-spesies radikal bebas dari amonium persulfat akan bereaksi dengan akrilamid sehingga terbentuk akrilamid aktif. Akrilamid
aktif ini akan bereaksi dengan akrilamid lainnya dengan cara yang sama sehingga terbentuk polimer yang panjang. Larutan yang mengandung polimer yang panjang ini tidak membentuk gel. Gel hanya
akan terbentuk apabila terdapat N,N’–metilen-bis-akrilamid. Polimerisasi menyebabkan terbentuknya jala dari rantai akrilamid. Ukuran pori dari jala tersebut ditentukan oleh jumlah akrilamid yang
digunakan per unit volume medium reaksi dan derajat ikatan silangnya Nur Adijuwana 1989. Adapun tahap pendahuluan yang perlu sebelum melakukan teknik elektroforesis adalah
denaturasi protein pada kondisi ekstrim misalnya panas, penambahan reduktor, deterjen, dan lain- lain yang dilanjutkan oleh pembungkusan dengan deterjen anionik. Pada tahap ini, protein sampel
dilarutkan dan didisosiasi menjadi subunit di dalam larutan buffer yang mengandung deterjen dan reducing agent. Detergen anionik yang umum dipakai adalah sodium dodesil sulfat SDS sehingga
15 teknik ini lebih dikenal sebagai SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
Elctrophoresis. Reduktor reducing agent seperti merkaptoetanol dan dithiothreithol digunakan untuk mereduksi ikatan disulfida di dalam subunit protein maupun antar subunit protein. Protein yang
mengikat SDS akan memiliki muatan negatif, sehingga pemisahan subunit protein hanya didasarkan atas ukuran partikelnya Nielsen 2003.
Bailey 1992 menuturkan, SDS merupakan grup ion sulfat dan rantai alkil lipofilik yang dapat menyebabkan peptida dan protein tidak saling berikatan yang dinamakan denaturasi. Kemudian SDS
mengelilinginya sehingga peptida dan protein bermuatan negatif. Akibatnya, semua peptida dan protein dalam campuran akan bermigrasi menuju anoda elektroda positif. Voet et al. 1999
menambahkan bahwa pergerakannya itu tidak lagi dipengaruhi oleh bentuk partikel karena denaturasi telah mengubah bentuk molekul menjadi seragam, yaitu berbentuk rantai lurus. Dengan demikian
pergerakan protein merupakan fungsi dari berat molekulnya. Kompleks SDS-protein yang lebih besar akan memiliki mobilitas yang lebih kecil daripada kompleks yang lebih kecil.
Kualitas resolusi data yang dihasilkan oleh teknik SDS-PAGE ditentukan oleh ukuran pori-pori polimer gel. Oleh sebab itu, persentase akrilamid yang digunakan pada tahap persiapan gel akan
mempengaruhi kemampuan elektroforesis dalam memisahkan protein. Persentase akrilamid yang diperlukan dalam fraksinasi protein disesuaikan dengan bobot molekul protein yang diperkirakan,
seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5.
Tabel 5. Persentase akrilamid yang digunakan untuk pemisahan molekul protein dengan kisaran berat molekul tertentu
Kisaran Berat Molekul Protein kD Persentase Akrilamid
200.000-60.000 5.0
120.000-30.000 7.5
75.000-18.000 10.0
60.000-15.000 12.5
45.000-12.000 15.0
Sumber: Copeland 1994
Proses elektroforesis dapat berlangsung dengan bantuan buffer sebagai medium yang menjaga konsistensi pH agar sampel protein tidak rusak. Menurut Copeland 1994, penggunaan buffer dalam
elektroforesis gel dapat dilakukan dengan dua macam sistem, yaitu sistem kontinyu homogenous dan sitem diskontinyu multiphasic. Sistem diskontinyu menggunakan dua macam gel dalam satu slab,
yakni stacking gel dan separating gel. Buffer dan konsentrasi akrilamid yang digunakan pada kedua jenis gel tersebut berbeda Boyer 1993. Stacking gel menggunakan buffer dengan pH 6.8 dan
konsentrasi akrilamid yang lebih rendah ukuran pori besar sedangkan separating gel menggunakan buffer dengan pH 8.8 dan konsentrasi akrilamid yang tinggi ukuran pori kecil pada proses
pembuatan gelnya. Sistem diskontinyu akan menghasilkan pemisahan yang baik dengan pita yang tajam karena protein terkonsentrasi pada stacking gel dan mengalami resolusi yang tinggi pada
separating gel Wilson Walker 2000. Setelah sampel melewati separating gel dan mengalami pewarnaan, hasilnya akan tampak seperti pada Gambar 4. Subunit protein akan terkelompokkan
berdasarkan bobot molekul yang tampak sebagai pita hitam.
16 Gambar 4. Hasil elektroforesis SDS-PAGE ekstrak protein dari berbagai galur varietas kedelai
Poysa et al. 2006
2.6 TEKSTUR
