37 API Campy. Isolat yang akan diidentifikasi merupakan isolat yang telah murni dan
dilakukan perbanyakan pada media blood agar base ditambah 5 darah domba yang telah lisis.
3.2.3. Bahan kimia
Bahan kimia yang digunakan untuk melakukan metode PCR polymerase chain reaction adalah Dream Taq
TM
master mix fermentas, primer, marker DNA, serta water nuclease free. Agarose gel elektroforesis yang dibuat dari agarose gel
mengandung ethidium bromide. Untuk pembuatan antigen diperlukan formalin pa, NaCl fisiologis, dan NaCl nonpyrogenic, glycine hydrochloride.
3.2.4. Peralatan
Alat yang diperlukan untuk isolasi dan identifikasi adalah ose, timbangan, gunting, pinset, Erlenmeyer, stomacher, alat vakum plastik, inkubator 42
o
C, jar anaerob ukuran 2.5 L. Melakukan uji PCR diperlukan mikropipet, tube PCR, mesin
PCR, electrophoresis horisontal, micro centrifuge, waterbath.
3.3. Metode 3.3.1. Isolasi dan identifikasi
3.3.1.1. Konvensional
Isolasi C. jejuni dari karkas ayam dilakukan menggunakan metode modifikasi dari International Organization for Standardization ISODIS 10272-
1994. Sampel karkas sebanyak 25 gram dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam kantong steril yang berisi media preenrichmnet Nutrient Broth No 2 yang
telah ditambah campylobacter growth supplement Oxoid SR0232E dan Preston selective suplemen Oxoid SR117E, kemudian digunakan stomacher untuk
melumatkan karkas ayam. Inkubasidilakukan pada suhu 42
o
C, dimasukkan kedalam jar yang telah diisi CampyGen Oxoid CN0025A untuk menyediakan kondisi
mikroaerofilik dengan atmosphere 5 O
2
, 10 CO
2
, 85 N
2
. Lama inkubasi selama 18-24 jam. Selanjutnya dilakukan inokulasi kultur pada media selective agar
CCDA dan kembali diinkubasikan pada suhu dan kondisi yang sama seperti sebelumnya selama 24-28 jam. Sebanyak 5 koloni yang khas yaitu berbentuk bulat
38 warna keabuan dan lengket disubkultur pada media agar darah, selanjutnya
dilakukan identifikasi uji motilitas, mikroskopis menggunakan pewarnaan Gram, uji katalase dan oksidase. Uji terhadap gula-gula glucose, sucrose, lactose dan
hidrolisa hipuratte dilakukan menggunakan Hasil identifikasi dengan teknik PCR diperoleh hasil 124 karkas ayam telah terkontaminasi Campylobacter sp., sebanyak
70 56.5 adalah C. jejuni dan 54 43.5 adalah C. coli, prosedur uji disesuaikan dengan petunjuk yang telah tersedia.
Pada saat melakukan isolasi maupun identifkasi terhadap sampel yang diuji, setiap tahap uji selalu disesuaikan dengan isolat standar Campylobacter jejuni
ATCC 33291. 3.3.1.2.
Polymerase Chain Reaction PCR
Sampel karkas ayam dalam suspensi media Nut Broth No 2 yang telah diinkubasi, diambil sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tube ukuran 1.8 ml
kemudian disentrifus menggunakan microcentrifuge dengan kecepatan 10 000 rpm pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Pelet yang diperoleh ditambahkan 1 ml akuades steril dan dikocok menggunakan vorteks kemudian disentrifus kembali dengan
kecepatan dan waktu yang sama seperti sebelumnya Alexandrino et al. 2004. Purifikasi DNA dilakukan dengan cara tube tersebut dipanaskan dalam air mendidih
dengan suhu 100
o
C dalam waterbath. Setelah 10 menit, suspensi segera didinginkan sehingga mencapai suhu 37
o
C dan disentrifus kembali dengan kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit, suspensi yang ada diambil sebagai DNA dan disimpan pada
suhu -20
o
C. Isolat Campylobacter sp. yang telah murni dan ditumbuhkan pada media
agar darah, diambil sebanyak 1 ose dimasukkan ke dalam 1 ml akuades kemudian dikocok
menggunakan divorteks.
Selanjutnya disentrifuse
menggunakan microsentrifuge dengan kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit pada suhu 4
o
C. Supernatan dibuang dan endapan pelet dibuat suspensi dengan ditambahkan100 l
akuades, kemudian suspensi dipanaskan pada suhu 100
o
C selama 10 menit dalam waterbath. Suspensi segera didinginkan sehingga mencapai suhu 4
o
C kemudian kembali disentrifuse 12 000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan
digunakansebagai DNA template, yang dapat disimpan pada 4
o
C selama kurang lebih 1 satu bulan atau -20
o
C selama berbulan-bulan.
39 Primer yang digunakan pada uji PCR dapat dilihat pada Tabel 5. Primer yang
digunakan adalah untuk mengidentifikasi gen hipO hippuricase dari C. jejuni, genglyA serine hydroxymethyl transferase dari C. coli. Selain itu untuk
mengidentifikasi Campylobacter thermophilic digunakan primer 23S rRNA. Spesies C. jejuni dan C. coli memiliki flagella yang diidentifikasi oleh primer dengan
sekuen gen fla.
Tabel 5 Susunan oligonukleotid primer
Primer Sekuen
Target Gen Ukuran
bp CJ-F
CJ-R ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC
GCC ACA ACA AGT AAA GAA GC C. jejuni hipO
323 CC-F
CC-R GTA AAA CCA AAG CTT ATC GTG
TCC AGC AAT GTG TGC AAT G C. coli glyA
126 23S-F
23S-R TAT ACC CGT AAG GAG TGC TGG AG
ATC AAT TAA CCT TCG AGC ACC G C. jejuni 23S rRNA
650 fla-F
fla-R GTA AAA CCA AAG CTT ATC GTG
TCCA GCA ATG TGT GCA ATG Flagella C. jejuni
450
Program amplifikasi yang dilakukan untuk primer forward maupun reverse CJ, CC dan 23S adalah sama yaitu 1 siklus pada suhu 95
o
C selama 6 menit kemudian 35 siklus pada suhu denaturasi 95
o
C selama 30 detik, suhu annealing 59
o
C selama 30 detik, dan suhu extension 72
o
C selama 30 detik kemudian dilanjutkan dengan 1 siklus pada suhu 72
o
C selama 7 menit Wang et al. 2002. Amplifikasi primer forward dan reverse fla dilakukan menggunakan modifikasi metode Wang et
al. 2002 pada suhu annealing 48
o
C, sedangkan suhu yang digunakan untuk tahap lainnya sama. Perkiraan suhu annealing dilakukan menggunakan perhitungan
banyaknya asam nukleotid yang menyusun primer, menggunakan rumus sebagai berikut :
Formulasi untuk PCR menggunakan volume larutan reaksi 50 µl terdiri dari PCR master mix 25 µl, masing-masing primer forward dan reverse 1 µl 0.25
Suhu annealing = 4G+C + 2 A+T
40 µMµl, water nuclease free 23 µl, 2 µl DNA template. Produk PCR yang dihasilkan
selanjutnya diseparasi secara elektroforesis dalam agarose gel 1 yang dilarutkan dalam 1x TBE Tris Boric EDTA ditambah 5 l ethidium bromide solution pada
tegangan 100 volt selama 60 menit, dimana agar direndam dalam larutan 1x TBE. Marker yang digunakan adalah 100 bp DNA ladder GeneRuler
TM
Fermentas. Gambar pita DNA didokumentasi menggunakan UV 254 nm trans-illuminator.
3.3.2. Produksi antibodi untuk pengembangan metode ELISA 3.3.2.1. Perbanyakan antigen
Antigen dibuat dari isolat lapang hasil isolasi dan identifikasi sampel karkas ayam. Isolat yang secara PCR menunjukkan spesies C. jejuni dipilih untuk
diperbanyak sebagai antigen. Isolat terpilih yang telah murni ditumbuhkan pada media Nutrient Broth No 2 dengan ditambah growth suplement dan selective
suplement. Inkubasi dilakukan pada suhu 42
o
C selama 48 jam pada kondisi mikroerofilik 5 O
2
, 10 CO
2
, 85 N
2
menggunakan jar yang diisi Campy gen. Perbanyakan dilakukan secara bertingkat dengan menumbuhkan 100 µl isolat murni
yang telah dithawing setelah dibekukan dalam 10 ml media cair diinkubasi pada suhu, waktu dan kondisi yang sama seperti di atas. Selanjutnya larutan suspensi
tersebut dimasukkan ke dalam 100 ml media cair, setelah selesai inkubasi larutan suspensi disubkultur pada 1000 ml media cair dan dilakukan inkubasi kembali.
Larutan suspensi 1000 ml yang diperoleh selanjutnya disiapkan sebagai antigen. Sebelum mikroorganisme dimatikan dengan cara menambahkan 1
formalin pa, dilakukan uji kemurnian terlebih dahulu dengan melakukan subkultur pada media selective CCDA. Larutan suspensi disentrifus selama 20 menit
menggunakan kecepatan 10 000 rpm. Pelet yang diperoleh dicuci 3 kali dengan cara menambahkan 100 ml NaCl fisiologis steril dan disentrifuse 10 000 rpm. Pelet yang
dihasilkan ditambah 10 ml NaCl nonpyrogenic selanjutnya disiapkan sebagai suspensi antigen. Antigen whole cell disiapkan dengan melakukan sonikasi suspensi
antigen selama 30 detik menggunakan sonicator. Pada saat proses sonikasi suspensi dipertahankan dalam kondisi suhu 4
o
C. Antigen flagela dibuat menggunakan metode ekstraksi glycine Logan
Trust 1983; Harris et al. 1987. Sebanyak 1 ml suspensi antigen Campylobacter
41 jejuni ditambahkan ke dalam 10 ml dalam 0.2 M glycine hydrochloride pH 2.2.
Suspensi distirer menggunakan magnet stirer pada suhu kamar selama 15 menit. Kemudian dilakukan sentrifuse 12 000 rpm selama 15 menit, supernatan yang
dihasilkan dinetralisasi menggunakan NaOH. Selanjutnya dilakukan dialisis dalam NaCl fisiologis suhu 4
o
C selama semalam. Antigen whole cell dan flagellin masing- masing dimasukkan ke dalam
buffer yang mengandung 5 vv 2-mercaptoethanol, 10 vv glycerol, 2 vv sodium dodecyl sulfate, dan 0.0625 M Tris base. Sampel dipanaskan pada suhu 100
o
C selama 3 menit. Sebanyak 5 µl sample yang mengandung 10 g protein
dimasukkan ke dalam tiap sumuran gel electrophoresis. Pemisahan protein menggunakan gel electrophoresis sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis SDS-PAGE dilakukan dalam 4.5 stacking gel dan 12 sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel. Electrophoresis dilakukan pada 8 mA semalam
atau menggunakan 4 stacking gel dan 10 separating gel Wenman et al. 1985.
3.3.2.2. Pembuatan antiserum
Antiserum dibuat dengan melakukan imunisasi antigen pada hewan percobaan. Hewan percobaan yang digunakan adalah kelinci Newzealand White
umur 2 bulan, domba 4 bulan, dan ayam SPF umur 1 bulan. Antigen whole cell konsentrasi 90 mg dan flagella 40 g yang telah diemulsikan dalam
Freund’s complete adjuvantFCA Sigma masing-masing diinjeksikan pada hewan kelinci
secara intramuskuler. Sebelum hewan percobaan diimunisasi, diambil darahnya terlebih dahulu untuk mengetahui titer antibodi preimunisasi.
Booster dilakukan secara subcutan pada hari ke-14 menggunakan antigen yang diemulsifikasi menggunakan
Incomplete Freund’s AdjuvantIFA Sigma Newell et al. 1984. Pengambilan serum dilakukan sepuluh hari setelah booster dan
setiap 2 minggu setelah pengambilan darah dilakukan. Titer antibodi yang terjadi diukur dengan menggunakan ELISA. Prosedur uji
yang digunakan adalah direct ELISA seperti yang telah dilakukan oleh Blaser dan Duncan 1984 dan Stird et al.2001, terlebih dahulu ditentukan optimal dilution
dari semua reagen secara checkerboard titration dan waktu serta temperatur yang optimum untuk inkubasi sebelum digunakan untuk menguji.
