Identifikasi bahaya Kajian Risiko Terjangkit Penyakit Tular Pangan
28 dari tiga tahap dalam setiap siklus amplifikasi, masing-masing ditentukan oleh suhu
yang berbeda untuk memungkinkan putusnya rantai ganda DNA, annealing primer, dan perpanjangan primer oleh polimerase, dengan melakukan antara 25 sampai 40
siklus Gambar 6.
Gambar 6 Tahapan setiap siklus amflifikasi dalam proses PCR
Primer adalah molekul DNA pendek beruntai tunggal, biasanya terdiri dari 18 sampai 35 basa yang diperlukan untuk replikasi. Sekuen DNA susunannya
spesifik untuk masing-masing organisme dengan urutan yang khas. PCR merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu secara enzimatik
melalui mekanisme perubahan suhu. Prinsip metode PCR adalah pada suhu 94-95
o
C, DNA mengalami denaturasi, pembelahan DNA untai ganda menjadi untai tunggal. Waktu yang diperlukan untuk proses ini sekitar 30 detik pada suhu 95
o
C atau 15 detik pada suhu 97
o
C. Denaturasi yang tidak lengkap akan menyebabkan renaturasi secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu lama dapat
mempengaruhi enzim polymerase, sehingga hal ini dapat mempengaruhi keberhasilan proses PCR. Umumnya sebelum proses siklus PCR dimulai seringkali
dilakukan tahap pre-denaturasi selama 3-5 menit untuk meyakinkan bahwa molekul DNA target yang akan dilipatgandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi
Sulandari Zein 2003. Apabila suhu diturunkan antara 36-72
o
C terjadi proses penempelan primer annealing yang merupakan penempelan primer pada DNA
yang telah terbelah pada tempat yang spesifik. Primer sebaiknya berukuran 18-25
29 basa. Semakin panjang primernya semakin tinggi temperatur annealing Sulandari
Zein 2003. Apabila suhu dinaikkan sampai 72
o
C, maka primer dengan bantuan enzim DNA polymerase akan membentuk untaian DNA sesuai dengan runutan DNA
yang terbelah, proses ini disebut elongasi extension. Umumnya setelah proses siklus PCR selesai, ditambah waktu post elongasi selama 5-10 menit pada
temperatur 72
o
C agar semua hasil PCR berbentuk untai ganda Sulandari Zein 2003. Ketiga tahapan tersebut merupakan satu siklus termal. Jumlah fragmen DNA
yang digandakan adalah 2
n
dimana n adalah banyaknya siklus termal. Rumus tersebut berasal dari penambahan jumlah keping copy DNA secara eksponensial,
dimana keping DNA yang terbentuk menjadi cetakan bagi reaksi selanjutnya. Banyaknya siklus yang dilakukan tergantung pada banyaknya produk PCR yang
diinginkan Sulandari Zein 2003. Menurut Sahin et al. 2003 metode molekuler PCR selain dapat mendeteksi
dan mengidentifikasi Campylobacter sp. juga dapat mendeteksi adanya bakteri patogen kontaminan yang lain pada bahan pangan. Analisis PCR pada bahan pangan
secara umum meliputi tahapan isolasi DNA dari sampel makanan, amplifikasi sekuen target secara PCR, visualisasi dengan melakukan separasi produk amplifikasi
pada elektroforesis gel agarosa sehingga diketahui ukuran fragmen yang dihasilkan dibandingkan dengan DNA marker setelah perlakuan staining menggunakan etidium
bromida. Metode PCR dapat mendeteksi dan mengidentifikasi Campylobacter sp.
tergantung primer yang digunakan. Primer gen 16S rRNA atau 23S rRNA umumnya digunakan untuk mendeteksi genus thermophilic Campylobacter pada lokasi
susunan sekuen gen hipO, flaA, mapA, ceuE, glyA, cadF atau lpxA Al Rashid 2000; Wang et al. 2002. Beberapa jenis uji PCR seperti multiplex PCR Wang et al. 2002
dan real-time PCR Logan et al. 2001 Sails et al. 1998 telah dilaporkan dapat mendeteksi Campylobacter sp. Multiplex PCR dilakukan menggunakan beberapa
primer spesifik dalam satu reaksi sehingga deteksi dan identifikasi dapat dilakukan secara bersamaan Sahin et al. 2003b. Real-time PCR dapat secara akurat mengukur
kuantitas DNA template dan dapat memberikan perkiraan jumlah organisme yang ada dalam sampel, meskipun memerlukan peralatan dan reagen yang lebih mahal
daripada metode PCR konvensional Sahin et al. 2003b. Metode PCR dapat digunakan untuk identifikasi enteropathogen C. jejuni dan C. coli menggunakan