PREVALENSI CAMPYLOBACTER JEJUNI DAN

51 Isolasi dan identifikasi bakteri patogen Campylobacter sp. sebagai kontaminan pada karkas ayam menggunakan metode konvensional diperoleh 59 19.8 dimana 48 81.4 diidentifikasi sebagai spesies C. jejuni dan C. coli 11 18.7. Hasil penelitian sebelumnya Humphrey et al. 2007 menyatakan bahwa infeksi campylobacteriosis pada manusia pada umumnya disebabkan oleh spesies C. jejuni dan C. coli yang berasal dari saluran pencernaan hewan terutama ayam. Menurut Frost 2001 sebagian besar kejadiannya gastroenteritis disebabkan oleh bakteri patogen Campylobacter jejuni dan Campylobacter coli. Gambar 15 Hasil uji API Campy isolat C. jejuni Karkas ayam yang dipakai sampel diambil di pasar tradisional dan swalayan dari beberapa kota di Jawa Barat, DKI Jakarta, dan Jawa Tengah dengan terlebih dahulu dilakukan isolasi dan identifikasi Campylobacter sp. Selanjutnya dilakukan uji menggunakan API Campy untuk mengidentifikasi dengan prinsip menguji isolat Campylobacter spp. secara biokimia Gambar 15. Menurut Hu dan Kopecko 2003 yang dapat membedakan C. jejuni dan C. coli dengan menggunakan uji hidrolisis enzim hipurat karena C. jejuni mampu menghidrolisis enzim tersebut sedangkan C. coli tidak. Hasil ini memperlihatkan bahwa karkas ayam yang diambil dari pasar tradisional maupun pasar swalayan masing-masing telah terkontaminasi oleh C. jejuni dan C. coli. Beberapa peneliti sebelumnya telah melaporkan bahwa daging ayam yang dijual di pasar di Amerika Serikat telah terkontaminasi C. jejuni dan C. coli adalah 2.3 sampai 98 Stern Line 1992; Meldrum et al. 2005; Stern Pretanik 2006. Identifikasi secara biokimia menggunakan metode yang sama 52 dengan API Campy telah dilaporkan oleh Flynn et al. 1994 bahwa 99 64.7 dari 153 sampel bagian sayap ayam positif terkontaminasi Campylobacter sp. Sebanyak 70 45.7 teridentifikasi C. jejuni dan C. coli. Sebanyak 45 29.4 C. jejuni dan 25 16.3 C. coli. Prevalensi isolat C. jejuni dan C. coli dari karkas ayam yang diperoleh dari pasar tradisional maupun swalayan dapat dilihat pada Gambar 16. Gambar 16 Prevalensi C. jejuni dan C. coli pada pasar tradisional dan swalayan Laporan hasil survei Meldrum et al. 2005 di Wales terhadap daging ayam yang dijual di pasar tradisional dan swalayan dinyatakan positif terkontaminasi Campylobacter sp. secara berurutan 73 n=565 dan 71 n=171. Pada penelitian ini, prosentase kontaminasi bakteri patogen C. jejuni dan C. coli pada karkas ayam yang diambil di pasar tradisional lebih rendah jika dibandingkan swalayan dapat dilihat pada Gambar 16. Secara metode konvensional dari 298 sampel diperoleh hasil bahwa karkas ayam yang dijual di pasar tradisional dan swalayan telah terkontaminasi Campylobacter sp. secara berurutan 17 kasus 5.7 dan 42 kasus 14.1. Isolat kontaminan Campylobacter sp. tersebut telah dilakukan identifikasi spesies sehingga diperoleh hasil secara konvensional di pasar tradisional dari 17 sampel yang terkontaminasi Campylobacter sp, sebanyak 15 88.2 adalah C. jejuni dan C. coli 2 11.8, dan identifikasi 42 sampel kontaminan Campylobacter sp. pada karkas ayam yang dijual di swalayan terdiri dari C. jejuni 33 kasus 78.57 dan C. coli 9 kasus 21.42. 5 10 15 20 25 30 35 C. jejuni C. coli Ps Tradisonal Swalayan 53 Poeloengan dan Noor 2003 pernah melaporkan adanya kontaminasi bakteri Campylobacter sp. pada karkas ayam yang dijual di pasar tradisional dan swalayan di daerah Bogor, isolasi menggunakan metode konvensional menghasilkan prosentase kontaminasi pada pasar tradisonal lebih rendah dari pada swalayan. Hal ini disebabkan karena bakteri Campylobacter sp. meskipun termasuk kelompok bakteri thermophilic namun bersifat fastidious, fragile dan tidak mampu berkompetisi dengan bakteri lain dalam pertumbuhannya. Penelitian Gill dan Haris 1982b menyatakan bahwa pertumbuhan Campylobacter sp. pada daging mengalami penurunan pada saat pertumbuhan mikroflora normal dan bakteri patogen lain jumlahnya meningkat maksimum mencapai 10 9 cm 2 . Hasil penelitian karkas ayam yang diambil dari pasar tradisional dijual tanpa penutup memungkinkan banyak bakteri kontaminan baik patogen maupun non patogen yang tumbuh dan mengurangi kesempatan Campylobacter sp. untuk tumbuh dan memperbanyak diri. Di pasar swalayan karkas dijual dengan dibungkus plastik memberikan kondisi atmosfer yang lebih optimal bagi pertumbuhan Campylobacter sp. yang bersifat microaerophilic, dimana adanya oksigen di udara dapat mengganggu pertumbuhan Campylobacter sp. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Balamurugan et al. 2011 dan Hilbert et al. 2010 yang menyatakan bahwa kemasan vakum pada daging dan adanya mikroflora normal yang tumbuh pada kemasan vakum seperti Pseudomonas sp. dapat meningkatkan kamampuan tumbuh dan berkembangnya C. jejuni. Perbedaan suhu penyimpanan karkas ayam mempengaruhi kemampuan pertumbuhan Campylobacter sp. Menurut Upton 1995 karkas ayam yang disimpan pada suhu 4 o C dengan kondisi vakum mampu hidup dan berproliferasi meskipun pada penyimpanan hari ke-28 hanya dapat dideteksi 500 sel per gram karkas. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa kontaminasi bakteri C. jejuni dan C. coli pada karkas ayam yang dijual di swalayan lebih tinggi dari pada karkas yang dijual di pasar tradisional, karena di swalayan karkas disimpan pada suhu refrigerator sehingga memungkinkan Campylobacter sp. masih mampu tumbuh dan berkembang. Didukung oleh hasil penelitian Huezo et al. 2007 bahwa proses chilling tidak mempengaruhi prevalensi Campylobacter pada karkas. Prevalensi kontaminasi Campylobacter sp. pada karkas ayam yang dijual di pasar tradisional lebih rendah dari pada swalayan tidak memberikan arti bahwa 54 karkas ayam yang dijual di pasar tradisional lebih baik. Menurut Meldrum et al. 2005 terdapat perbedaan yang nyata adanya kontaminasi Salmonella pada karkas ayam yang dijual di pasar tradisional lebih tinggi dari pada di toko daging yang dilengkapi dengan pendingin. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian ini bahwa karkas ayam yang dijual di pasar tradisional dengan cara penyimpanan terbuka dan disimpan pada suhu kamar memungkinkan lebih banyak mengandung bakteri patogen sebagai kontaminan selain Campylobacter sp. Meskipun pervalensi Campylobacter sp. pada karkas ayam yang dijual di pasar tradisional memperlihatkan lebih rendah dari swalayan namun dosis infeksi bakteri patogen Campylobacter jejuni sangat rendah yaitu 900 sel hidup Stern Pretanik 2006, sehingga, apabila manusia mengkonsumsi karkas ayam yang telah terkontaminasi Campylobacter sp. dapat menyebabkan campylobacteriosis. Menurut Kramer et al. 2000 dan Gurtler 2005 terdapat beberapa jenis spesies Campylobacter yang dapat diisolasi dari karkas ayam. Adanya perbedaan prevalensi C. jejuni dan C. coli sebagai kontaminan pada bahan pangan menyebabkan perbedaan faktor risiko sehingga strategi kontrol yang perlu dilakukan juga berbeda. Menurut Mateo et al. 2005 spesies C. jejuni dan C. coli merupakan mikroba yang umumnya mengkontaminasi karkas ayam, namun Tam et al. 2003 melaporkan bahwa terdapat perbedaan morbiditas dan mortalitas yang ditimbulkan oleh masing-masing spesies tersebut. Menurut Allos 2001 penanganan yang tidak baik selama prosesing pada karkas ayam di rumah potong serta meningkatnya konsumsi daging ayam dapat merupakan sumber utama infeksi pada manusia. Adanya kontaminasi spesies C. jejuni dan C. coli pada karkas ayam pada penelitian ini dengan prevalensi yang berbeda memberikan laporan pentingnya peranan kesehatan masyarakat dalam penyediaan bahan pangan yang berkualitas. Sesuai dengan laporan Tam et al. 2003 bahwa meskipun C. coli mempunyai peran minor dalam menyebabkan campylobacteriosis pada manusia tetapi mempunyai berpengaruh cukup besar pada kesehatan manusia. Usaha untuk mengurangi jumlah kontaminasi Campylobacter sp. dapat dilakukan dengan melakukan dekontaminasi. Menurut Li et al. 2002 dekontaminasi karkas ayam menggunakan klorin seperti yang biasa dilakukan pada karkas ayam yang dijual di pasar tradisional dan swalayan konsentrasi 50 ppm dapat menurunkan jumlah Campylobacter sp. sebanyak 1 log cfu karkas. Peningkatkan sanitasi termasuk klorinasi air dan higiene 55 pada saat produksi karkas ayam, mengurangi kejadian kontaminasi silang dan memisahkan bahan mentah sebagai sumber kontaminan dengan bahan pangan siap saji, memegang peranan cukup penting untuk mengurangi terjadinya infeksi Campylobacter sp. pada manusia. SIMPULAN Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa karkas ayam yang dijual pada pasar tradisional dan swalayan di daerah DKI Jakarta, Jawa Barat Bogor dan Sukabumi, Jawa Tengah Kudus dan Demak positif terkontaminasi bakteri enteropatogen C. jejuni dan C. coli. Spesies C. jejuni adalah kontaminan utama karkas ayam yang dijual di pasar tradisional dan swalayan dengan angka prevalensi yang lebih lebih tinggi dari C. coli. Prevalensi kontaminasi Campylobacter sp. 59 19.8 terdiri dari 48 81.4 spesies C. jejuni dan C. coli 11 18.7. Kontaminasi Campylobacter sp. di pasar swalayan, 42 kasus 14.1 lebih tinggi jika dibandingkan pasar tradisional 17 kasus 5.7. Sebanyak 42 sampel dari karkas yang dijual di swalayan 33 kasus 78.57 adalah C. jejuni dan 9 kasus 21.42 adalah C. coli, sedangkan 17 isolat positif Campylobacter sp. dari karkas ayam yang dijual di pasar tradisional sebanyak 15 88.2 adalah C. jejuni dan C. coli 2 11.8. Keberadaan kontaminasi C. jejuni dan C. coli sebagai agen foodborne enteropatogen pada karkas ayam dapat menyebabkan infeksi pada manusia sehingga merupakan masalah yang perlu mendapat perhatian dalam bidang kesehatan masyarakat. DAFTAR PUSTAKA Allos BM. 2001. Campylobacter jejuni infections: update on Emerging issues and trends. Invited Article. Food Safety 32: 1201-1206. Balamurugan S, Nattress FM, Baker LP, Dilts BD. Survival of Campylobacter jejuni on beef and pork under vacuum packaged and retail storage conditions: examination of the role of natural meat microflora on C. jejuni survival. Food Microbiol 30: 1-8. Barrow, Feltham. 2003. Character of gram-negative bacteria. Di dalam Cowan and Steel’s manual for the identification of medical bacteria. New York: Cambridge University Press. 56 Flyn OMJ, Ian SB, David AM. 1994. Prevalence of Campylobacter species on fresh retail chicken wings in Northern Ireland. J Food Prot 574: 334-336. Frost JA. 2001. Current epidemiology issues in human campylobacteriosis. J Appl Microbiol 30: 85-95. Gill CO, Haris LM. 1982b. Survival and growth of Campylobacter fetus subs. jejuni on meat and cooked foods. Appl Environ Microbiol 442: 259-263. Gillespie IA, O’Brien SJ, Frost JA. 2002. A case-case comparison of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni infection: a tool for generating hypotheses. Emerg Infect Dis 89: 937-942. Gurtler M, Alter T, Kasimir S, Fehlhaber K. 2005. The importance of Campylobacter coli in human campylobacteriosis: prevalence and genetic characterization. Epidemiol Infect 133: 1081-1087. Hariharan H, Murphy GA, Kempf I. 2004. Campylobacter jejuni: public health hazards and potential control methods in poultry: a review. Vet Med-Czech 4911: 441-446. Hilbert F, Scherwitzel M, Paulsen P, Szostak M. 2010. Survival of Campylobacter jejuni under condition of atmospheric oxygen tension with the support of Pseudomonas spp. Appl Environ Microbiol 7617: 5911-5917. Huezo R, Northcutt JK, Smith DP, Fletcher DL, Ingram KD. 2007. Effect of dray air or immersion chilling on recovery of bacteria from broiler carcasses. J Food Prot 708: 1829-1834. Hu I, Kopecko. 2003. Campylobacter spesies. Di dalam: International Handbook of Foodborne Pathogens. Miliotis MD, Bier JF, editor. New York: Marcell Dekker. Humphrey T, O’Briens S, Madsen M. 2007. Campylobacters as zoonotic pathogens: A food production perspective. Int J Food Microbiol 117: 237-257. Kramer JM, Frost JA, Bolton FJ, Wareing DRA. 2000. Campylobacter contamination of raw meat and poultry at retail sale: identification of multiple types and comparison with isolates from human infection. J Food Prot 6312: 1654-1659. Li Y, Yang H, Swem BL, 2002. Effect of high-temperature inside-outside spray on survival ofCampylobacter jejuni attached to prechill chicken carcasses. Poult Sci 81: 1371-1377. Mateo E, Carcamo J, Urquijo M, Perales I, Fernandez-Astorga A. 2005. Evaluation of a PCR assay for the detection and identification of Cmpylobacter jejuni and Campylobacter coli in retail poultry products. Res in Microbiol: 156- 568. Meldrum RJ, Tucker D, Smith RMM, Edwards C. 2005. Survey of Salmonella and Campylobacter contamination of whole, raw poultry on retail sale in Wales in 2003. J Food Prot 687: 1447-1449. 57 Oyofo et al. 2002. Surveilance of bacterial pathogens of diarrhea disease in Indonesia. Diag Microbiol and Infect Dis 44: 227-234. Poeloengan M, Noor SM. 2003. Isolasi Campylobacter jejuni pada daging ayam dari pasar tradisional dan supermarket. Di Dalam: Prosiding Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor: Puslitbang Peternakan. Stern NJ, Line JE. 1992. Comparion of three methods of recovery of Campylobacter spp. from broiler carcasses. J Food Prot 55: 663-666. Stern NJ, Pretanik S. 2006. Counts of Campylobacter spp. on U.S. broiler carcasses. J Food Prot 695: 1034-1039. Tam CC, Brien SJO, Adak GK, Meakins SM, Frost JA. 2003. Campylobacter coli –- an important foodborne pathogens. J Infect 47: 28-32. Tjaniadi P, Lesmana M, Subekti D, Machpud N, Komalarini S, Santoso W, Simanjuntak CH, Punjabi N, Campbell JR, Alexander WK, Beecham HJ, Corwin AL, Oyofo BA. 2003. Antimicrobial resistance of bacteria pathogens associated with diarrheal patients in Indonesia. Am J Trop Med Hyg 686: 666-670. Upton M. 1995. Relationship between pathogen growth and the general microbiota on raw and processed meat and poultry. J Food Safety 15: 133-144. Wheeler JG, Sethi D, Cowden JM, Wall PG, Rodrigues LC, Tomkins DS, Hudson MJ, Roderick PJ. 1999. Study of infectious intestinal disease in England: rates in community, presenting to general practice and reported to national surveillance. British Medical J Clinical research ed 318: 1046-1050. [WHO] World Health Organization. 2000. The increasing incidence of human campylobacteriosis: report and proc. Of a WHO Consultation of Experts, Copenhagen, 21-25 November. WHOCDCCSRAPH2001.7. Geneva. 59

5. METODE PCR UNTUK DETEKSI CAMPYLOBACTER sp.

PADA KARKAS AYAM ABSTRAK Campylobacter sp. adalah bakteri agen foodborne zoonosis yang menyebabkan gastroenteritis akut pada manusia. Daging ayam telah dilaporkan sebagai sumber infeksi C. jejuni pada manusia. Metode konvensional untuk deteksi bakteri yang ditularkan melalui bahan makanan memerlukan waktu lebih lama dengan terlebih dahulu menumbuhkan bakteri pada media dan dilanjutkan dengan identifikasi secara biokimia. Metode cepat polymerase chain reaction PCR untuk mendeteksi Campylobacter sp. telah banyak dilaporkan. Terhadap 298 sampel karkas ayam yang dibeli dari swalayan dan pasar tradisional dilakukan isolasi Campylobacter mengikuti ISO DIS 10272-1994 dan selanjutnya dilakukan identifikasi menggunakan API Campy. Metode PCR menggunakan dua pasang primer digunakan untuk melakukan isolasi dan identifikasi C. jejuni dan C. coli. Prevalensi kontaminasi Campylobacter sp. pada daging ayam lebih tinggi pada uji PCR 41.6 dibandingkan dengan cara konvensional 19.8. Hal tersebut menunjukkan bahwa metode PCR lebih sensitif jika dibandingkan dengan metode konvensional untuk mendeteksi kontaminan Campylobacter sp. dengan batas minimum deteksi C. jejuni 10 3 cfu ml. Kata kunci : polymerase chain reaction, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, daging ayam. ABSTRACT Campylobacter sp. is the most commonly reported as agent offoodborne zoonosiscause of acute gastroenteritis in humans. Poultry meat is considered a major source of C. jejuni infection for human. The conventional methods to detect foodborne bacteria often rely on time-consuming growth in culture media, followed by biochemical identification. Polymerase chain reaction PCR technique for rapid identification of the pathogens Campylobacter sp. was undertaken. There are 298 chicken carcass samples sold insupermarkets and traditional markets have been carried out in accordance isolation protocol ISO DIS 10272-1994. Identification is performed using biochemical API Campy. The PCR assay with two sets of primers was employed for isolation and identification of C. jejuni and C. coli. The result of the isolation and identification either by conventional or PCR methods showed that chicken carcasses both from traditional market and supermarket were contaminated with C. jejuni and or C. coli. Prevalence of Campylobacter sp. contaminant in chicken meat was higher by PCR 41.6 than by conventional 19.8, indication that PCR technique is more sensitive than conventional method with detection limit for C. jejuni was10 3 cfuml. Key words : polymerase chain reaction, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, poultry meat 60 PENDAHULUAN Campylobacter jejuni adalah bakteri agen foodborne zoonosis yang menyebabkan gastroenteritis akut pada manusia. Genus Campylobacter termasuk dalam famili Spirallaceae. Campylobacteriosis disease dapat disebabkan oleh infeksi Campylobacter sp. kelompok termofilik, yaitu Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, dan Campylobacter laridis Shane 2000. Selain menyebabkan gastroenteritis pada manusia, infeksi C. jejuni juga berhubungan dengan kondisi autoimmune yang disebut Guillain-Barre Syndrome GBS Raymond et al. 2001. C. jejuni dan C. coli adalah bakteri enterik yang patogen pada manusia dan hewan. Kejadian campylobacteriosis telah banyak dilaporkan baik di negara-negara maju maupun berkembang. Kejadian campylobacteriosis pada manusia di Indonesia pernah dilaporkan oleh Ringertz et al. 1980. Poeloengan dan Noor 2003 melaporkan bahwa karkas ayam yang diperoleh dari pasar tradisional dan supermarket di daerah Jakarta, Sukabumi, dan Bogor telah terkontaminasi C. jejuni. Di Taiwan, dilaporkan bahwa sebanyak 55, 20, 30, dan 30 masing-masing dari karkas ayam, bebek, babi dan susu segar dapat diisolasi C. jejuni Shao et al. 2006. Di Irlandia Utara dilaporkan 64.7 karkas ayam telah terkontaminasi oleh C. dan C. coli Flynn et al.1994. Dosis infeksi C. jejuni pada manusia sangat rendah yaitu 500-900 sel Stern Pretanik 2006. Sumber utama infeksi disebabkan karena mengkonsumsi daging ayam, daging sapi, dan susu yang telah terkontaminasi. Menurut Lindqvist et al. 2000 dan Kramer et al. 2000, kontaminasi C. jejuni yang paling banyak terjadi adalah pada daging ayam. Kejadian infeksi Campylobacter sp. pada hewan sangat bervariasi, akan tetapi infeksi C. jejuni pada peternakan ayam memegang peranan penting. Usaha mengurangi kejadian infeksi pada ayam merupakan usaha yang penting untuk memperbaiki sistem produksi dan untuk mengeliminasi atau mengurangi kejadian kontaminasi agen infeksi C. jejuni serta mempunyai peranan penting untuk kesehatan masyarakat. Metode cepat untuk deteksi C. jejuni sangat diperlukan untuk mengetahui sumber kontaminasi. Metode PCR merupakan deteksi cepat dan sensitifuntuk menentukan keberadaan bakteri patogen dalam sampel tanpa melakukan isolasi DNA Fode-Vaughan et al. 2001. Metode PCR digunakan sebagai teknik deteksi 61 dasar dalam produksi bahan pangan untuk meningkatkan standar keamanan pangan Archana Taha 2010. Menurut Blackburn dan Clure 2003 Campylobacter sp. adalah mikroorganisme yang sulit dikultur. Pendekatan secara molekuler untuk mendeteksi bakteri kontaminan dalam bahan pangan terutama Campylobacter sp. mampu membedakan sampai tingkat spesies. Metode PCR telah dikembangkan oleh peneliti sebelumnya dengan menggunakan primer yang spesifik untuk mendeteksi C. jejuni. Gonzales et al. 1997 melakukan penelitian menggunakan gene probe ceuE sebagai komponen binding protein transport system terhadap siderophore enterochelin. Sekuen gen cdt dapat digunakan untuk membedakan spesies C. jejuni dan C. coli Eyigor et al. 1999. Penelitian ini dilakukan unuk isolasi C. jejuni secara konvensional menggunakan media selektif dan deteksi cepat molekular secara PCR. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui sensitivitas metode PCR mendeteksi Campylobacter sp. pada daging ayam yang dijual di swalayan dan pasar tradisonal sebagai agen foodborne disease dengan menggunakan pasangan primer hipO sebagai novel primer untuk menentukan spesies C. jejuni dan pasangan gene glyA untuk membedakan spesies C. jejuni dan C. coli Wang et al. 2002. BAHAN DAN METODE Sampel Sebanyak 298 sampel karkas ayam diperoleh dari pasar tradisional dan swalayan di daerah DKI Jakarta, Jawa Barat Bogor dan Sukabumi, dan Jawa Tengah Demak dan Kudus. Sampel yang dikoleksi dimasukkan ke dalam kantung plastik kedap udara, kemudian dimasukkan ke dalam boks pendingin untuk dibawa ke laboratorium untuk dilakukan uji. Laboratorium yang digunakan penelitian adalah laboratorium Bakteriologi Balai Besar Penelitian Veteriner, Laboratorium Kesmavet Fakultas Kedokteran Hewan IPB, dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Isolat standar murni Isolat murni diperoleh dengan melakukan subkultur pada media selective yang mengandung enrichment seperti pada metode isolasi dalam Bab 4. Beberapa koloni isolat standar American Type Culture Collection ATCC Campylobacter sp. 62 hasil isolasi dimasukkan ke dalam 1 ml akuades kemudian dikocok dengan menggunakan vorteks. Kekeruhan diukur pada OD 0.3 dengan panjang gelombang 600 nm, dan disentrifus dengan kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit. Purifikasi DNA dilakukan dengan cara menambahkan akuades 100 l 1:500 pada pelet, kemudian dipanaskandalam air mendidih dengan suhu 100 o C. Setelah 10 menit dipanaskan, segera didinginkan dan disentrifus kembali dengan kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit, suspensi yang diperoleh merupakan DNA Alexandrino et al. 2004. Kultur pengkayaan Sampel karkas ayam dalam suspensi media Nut Broth No 2 yang telah diinkubasikan dapat dilihat pada Metode sub Bab 4 mengenai isolasi dan identifikasi secara konvensional, diambil sebanyak 1 ml kemudian disentrifus dengan kecepatan 10 000 rpm pada suhu 4 o C selama 10 menit. Pelet yang diperoleh ditambah 1 ml akuades dan disentrifus kembali dengan kecepatan kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit. Purifikasi DNA dilakukan dengan cara menambahkan akuades 100 l 1:500 pada pelet, kemudian dipanaskandalam air mendidih dengan suhu 100 o C. Setelah 10 menit, suspensi segera didinginkan dan disentrifus kembali dengan kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit, selanjutnya suspensi yang ada diambil sebagai DNA Alexandrino et al. 2004. Sensitivitas Uji PCR Menentukan limit deteksi uji DPCR dilakukan untuk mengetahui jumlah minimum koloni cfuml yang mampu dideteksi dengan metode DPCR menggunakan pasangan basa gen hipO. Besarnya sensitivitas ditentukan dengan menumbuhkan suspensi koloni yang sudah dilakukan pengenceran berseri. Suspensi yang telah diketahui jumlah koloni pada masing-masing pengenceran selanjutnya dilakukan purifikasi DNA dengan teknik seperti di atas. Sensitivitas dan spesifitas uji PCR dianalisa sesuai dengan ISO 1610-2003 Anonim 2003. Deteksi Campylobacter spp. dengan PCR Wang et al. 2002 Primer yang digunakan adalah untuk mengidentifikasi gen hippuricase hipO, serine hydroxymethyl transferase glyA dan 23S rRNA. Amplifikasi DNA 63 dilakukan pada mesin PCR dengan 35 cycle pada suhu initial denaturation 95 ° C selama 6 menit, denaturation 95 ° C selama 30 detik, annealing 59 ° C selama 30 detik, extension 72 ° C selama 30 detik dan final extension 72 ° C selama 7 menit. Hasil PCR kemudian diperiksa dengan electrophoresis gel agarose. Agarose gel invitrogen, New Zealand 1 dengan 1x TBE Tris Boric EDTA invitrogen, New Zealand ditambah 5 l ethidium bromide Sigma, Germany solution dalam 100 ml. Run electrophoresis 150 volt selama 30 menit. Primer yang digunakan untuk mengidentifikasi gen hippuricase hipO dan serine hydroxymethyl transferase glyA disajikan pada. Amplifikasi DNA dilakukan pada mesin PCR dengan 35 cycle pada suhu initial denaturation 95 o C selama 6 menit, denaturation 95 o C selama 30 detik, annealing 59 o C selama 30 detik, extension 72 o C selama 30 detik dan final extension 72 o C selama 7 menit Wang et al. 2002. Produk PCR kemudian diperiksa dengan electrophoresis gel agarose. Agarose gel 1 dengan 1x TBE Tris Boric EDTA ditambah 5 l ethidium bromide solution. Run electrophoresis 150 volt selama 30 menit, visualisasi untuk melihat pita gen target digunakan transluminator ultraviolet. HASIL DAN PEMBAHASAN Untuk mendeteksi keberadaan Campylobacter sp. secara PCR, salah satunya menggunakan susunan basa primer 23S rRNA yang merupakan kontrol gen yang bersifat highly polymorphic terletak di helix antara 43 dan 69 Eyers et al. 1993; Fermer Engvall 1999; Rashid et al. 2000; Wang et al. 2002 untuk mendeteksi keberadaan Campylobacter sp. Gen rRNA memiliki struktur mosaik yang conserve. Sekuen asam nukleat gen 23S rRNA dapat mengidentifikasi beberapa strain bakteri termofilik Campylobacter spesies yaitu C. jejuni, C. coli, C. lari, dan C. upsaliensis Eyers et al. 1993. Gambar 17 memperlihatkan bahwa sampel pada sumur 1 sampai 17 yang diuji secara PCR menggunakan primer hipO dan glyA menunjukkan positif spesies C. jejuni pada sumur 5, 6, 12, dan 14 sedangkan C. coli pada sumur 2-4, 9, dan 15- 17. Kontaminasi bakteri thermophilic Campylobacter pada karkas ayam pada pasar tradisional dan swalayan di lokasi pengambilan sampel tidak hanya spesies C. jejuni saja tetapi juga C. coli. Spesies C. jejuni merupakan agen penyebab infeksi gastrointestinal yang utama pada manusia namun bakteri C. coli juga dianggap 64 sebagai agen foodborne disease yang penting meskipun angka kejadiannya lebih rendah Tam et al. 2003. Spesies C. jejuni menyebabkan campylobacteriosis pada manusia mencapai 90 sedangkan spesies C. coli berkisar 5-10 Gillespie et al. 2002. Gambar 17 Produk PCR menggunakan primer hipO dan glyA yang diseparasi dalam agarose 1 dari dari sampel sumur 1-17 yang diuji. Sebagai kontrol positif digunakan isolat ATCC C. jejuni 323 bp pada sumur 19 dan ATCC C. coli 126 bp pada sumur 18. Hasil yang diperoleh peneliti Gurtler et al. 2005 adalah sebanyak 18.6 campylobacteriosis pada manusia disebabkan oleh spesies C. coli. Hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa dari 59 isolat positif Campylobacter sp. 11 18.6 adalah C. coli diuji secara metode konvensional. Sedangkan dari 124 dideteksi Campylobacter sp. secara PCR sebanyak 54 43.5 adalah spesies C. coli. Meskipun prevalensi kontaminasi C. coli lebih rendah jika dibandingkan dengan C. jejuni dan menyebabkan campylobacteriosis minor pada manusia namun kenyataannya dapat mengakibatkan gangguan kesehatanyang cukup serius pada manusia karena hasil yang diperoleh oleh Tam et al. 2003 memperlihatkan bahwa di England sebanyak 25 000 kasus foodborne disease disebabkan oleh spesies C. coli sehingga menyebabkan 12 000 menderita sakit dengan 1000 pasien dirawat di rumah sakit dan 11 orang meninggal. Peternakan ayam dan sapi perah serta produknya merupakan sumber utama infeksi C. jejuni sedangkan perternakan babi serta produknya berperan terhadap infeksi C. coli Gillespie et al. 2002; Alter et al. 2005. Hasil penelitian Gurtler et al. 2005 menyatakan bahwa spesies C. coli jugaberperan pada infeksi Campylobacter pada manusia namun terdapat perbedaan sumber infeksi. Pada penelitian ini, sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 323 bp 126 bp 65 karkas ayam yang diperiksa menunjukkan bahwa karkas telah terinfeksi oleh C. jejuni dan C. coli. Gambar 18 Hasil PCR menggunakan primer hipO yang diseparasi dalam agarose 1 dari isolat yang berasal dari ATCC C. jejuni pada sumur 7 sebagai kontrol positif dengan target gen 323 bp dan sampel pada sumur 1-6 Karakterisasi genetik isolat Campylobacter sp. dilakukan secara PCR. Primer yang digunakan yaitu gen hipO dan glyA. Gen hipO hippuricase merupakan novel primer yang hanya terdapat pada C. jejuni. Strain ini memberikan reaksi positif pada uji hidrolisis hippurate Wang et al. 2002, sedangkan C. coli memberikan reaksi negatif Nakari et al. 2008 dengan besaran target gen yang diharapkan yaitu C. jejuni pada 323 bp. Target gen C. jejuni menggunakan primer gen hipO terdapat pada lokasi gen 1662-1965 bp menunjukkan hasil positif C. jejuni pada pita 323 bp yang disajikan pada Gambar 18. Gen glyA mengkode serine hydroxymethyl transferase bersifat sangat conserve yang terdapat pada Campylobacter thermophilic seperti C. coli, C. lari, C. upsaliensis Wang et al. 2002. Lokasi gen target terletak pada 337-444 bp dengan ukuran 126 bp Gambar 19. Bakteri spesies C. jejuni dan C. coli yang mengkontaminasi daging ayam merupakan bakteri penyebab enterokolitis pada manusia. Wabah Campylobacter enteritis yang terjadi terutama disebabkan karena mengkonsumsi daging ayam yang terkontaminasi oleh C. jejuni Fang et al. 2006, sekalipun demikian spesies C. coli juga telah dilaporkan sebagai agen penyebab enteritis pada manusis Flyn et al. 1994. Jamshidi et al. 2008 melaporkan bahwa metode PCR menggunakan primer 1 2 3 4 5 6 7 66 cadF dapat mendeteksi kontaminasi genus Campylobacter sp. 76 lebih banyak dari C. coli 2 pada daging ayam. Spesies C. coli umumnya lebih banyak ditemukan pada daging babi. Kasus infeksi C. coli sehingga menyebabkan enteritis pada manusia di Denmark jarang terjadi, namun infeksi diperkirakan akibat mengkonsumsi daging babi Cabrita et al. 1992. Meskipun belum jelas kasus enteritis akibat mengonsumsi daging babi atau ayam yang terkontaminasi C. jejuni atau C. coli, tetapi hasil penelitian Boes et al. 2005 melaporkan bahwa daging babi telah terkontaminasi spesies C. jejuni dan C. coli. Gambar 19 Hasil PCR menggunakan primer glyA sumur 1-9 dan hipO sumur 10 dan 11 isolat yang berasal dari sampel sumur 2-9 dan ATCC C. coli sumur1 sebagai kontrol positif dengan target gen 126 bp Hasil identifikasi dengan teknik PCR diperoleh hasil 124 41.6 karkas ayam telah terkontaminasi Campylobacter sp. Dari 124 sampel positif Campylobacter sp. sebanyak 70 56.5 adalah C. jejuni dan 54 43.5 adalah C. coli. Hal tersebut memperlihatkan bahwa karkas ayam yang dijual di pasar tradisional dan swalayan di DKI Jakarta, Jawa Barat Bogor dan Sukabumi dan Jawa Tengah Kudus dan Demak telah terkontaminasi oleh bakteri Campylobacter spp, terutama spesies C. jejuni dan C. coli. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11