Karakterisasi bahaya Kajian Risiko Terjangkit Penyakit Tular Pangan
29 basa. Semakin panjang primernya semakin tinggi temperatur annealing Sulandari
Zein 2003. Apabila suhu dinaikkan sampai 72
o
C, maka primer dengan bantuan enzim DNA polymerase akan membentuk untaian DNA sesuai dengan runutan DNA
yang terbelah, proses ini disebut elongasi extension. Umumnya setelah proses siklus PCR selesai, ditambah waktu post elongasi selama 5-10 menit pada
temperatur 72
o
C agar semua hasil PCR berbentuk untai ganda Sulandari Zein 2003. Ketiga tahapan tersebut merupakan satu siklus termal. Jumlah fragmen DNA
yang digandakan adalah 2
n
dimana n adalah banyaknya siklus termal. Rumus tersebut berasal dari penambahan jumlah keping copy DNA secara eksponensial,
dimana keping DNA yang terbentuk menjadi cetakan bagi reaksi selanjutnya. Banyaknya siklus yang dilakukan tergantung pada banyaknya produk PCR yang
diinginkan Sulandari Zein 2003. Menurut Sahin et al. 2003 metode molekuler PCR selain dapat mendeteksi
dan mengidentifikasi Campylobacter sp. juga dapat mendeteksi adanya bakteri patogen kontaminan yang lain pada bahan pangan. Analisis PCR pada bahan pangan
secara umum meliputi tahapan isolasi DNA dari sampel makanan, amplifikasi sekuen target secara PCR, visualisasi dengan melakukan separasi produk amplifikasi
pada elektroforesis gel agarosa sehingga diketahui ukuran fragmen yang dihasilkan dibandingkan dengan DNA marker setelah perlakuan staining menggunakan etidium
bromida. Metode PCR dapat mendeteksi dan mengidentifikasi Campylobacter sp.
tergantung primer yang digunakan. Primer gen 16S rRNA atau 23S rRNA umumnya digunakan untuk mendeteksi genus thermophilic Campylobacter pada lokasi
susunan sekuen gen hipO, flaA, mapA, ceuE, glyA, cadF atau lpxA Al Rashid 2000; Wang et al. 2002. Beberapa jenis uji PCR seperti multiplex PCR Wang et al. 2002
dan real-time PCR Logan et al. 2001 Sails et al. 1998 telah dilaporkan dapat mendeteksi Campylobacter sp. Multiplex PCR dilakukan menggunakan beberapa
primer spesifik dalam satu reaksi sehingga deteksi dan identifikasi dapat dilakukan secara bersamaan Sahin et al. 2003b. Real-time PCR dapat secara akurat mengukur
kuantitas DNA template dan dapat memberikan perkiraan jumlah organisme yang ada dalam sampel, meskipun memerlukan peralatan dan reagen yang lebih mahal
daripada metode PCR konvensional Sahin et al. 2003b. Metode PCR dapat digunakan untuk identifikasi enteropathogen C. jejuni dan C. coli menggunakan
30 probe gene ceuE yang diduga mengkode faktor virulensi Campylobacter Gonzales
et al. 1997. Peneliti Mateo et al. 2005 telah mengembangkan metode PCR sebagai alat deteksi dan identifikasi C. jejuni dan C. coli yang mengkontaminasi produk
perunggasan menggunakan probe gene mapA dan ceuE. Eyigor et al. 1999 melakukan deteksi dan analisa isolat C. jejuni dan C. coli menggunakan metode
PCR menggunakan gen cytolethal distending toxin cdt, gen cdt yang dihasilkan oleh C. jejuni dan C. coli dan merupakan faktor virulen dari kedua spesies tersebut,
memperlihatkan sekuen yang berbeda. Susunan nukleotida primer yang dapat digunakan untuk identifikasi Campylobacter sp. disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Primer yang digunakan untuk mendeteksi genus Campylobacter
Primer Gen Target
Produk PCR bp
Referensi cadF
ceuE 23S
rRNA 16S
rRNA glyA
fla hipO
sapB2 asp
cdt omp50
outer membran proteinCampylobacter komponen lipoprotein enterochelin C. coli
thermophilic Campylobacter sp. Campylobacter sp.
Serine hydroxymethyltransferase C. coli, C. lari, C. upsaliensis
Flagellin C. jejuni, C. coli Hippuricase C. jejuni
Surface layer protein C. fetus subs. fetus Aspartokinase C. coli
cytolethal distending toxinC. jejuni dan C. coli
outer membrane proteinCampylobacter sp. 400
894 650
816 126
450 323
435 500
- 1100
Nayak et al. 2005 Nayak et al. 2005
Trust et al. 1994; Eyers et al. 1993
Linton et al. 1997; Kulkarni et al. 2002
Rashid et al. 2000 Oyofo et al. 1992
Wang et al. 2002 Wang et al. 2002
Linton et al. 1997; Amri et al. 2007
Eyigor et al. 1999 Dedieu et al. 2004
31