31
2.5.2.2. Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay ELISA
Metode cepat secara immunochemical menggunakan antibodi merupakan uji yang sensitif untuk mendeteksi bakteri kontaminan pada bahan pangan
Blankenfeld-Enkvist Brannback 2002. Metode cepat yang dapat dikembangkan antara lain uji latex-agglutination, immunodiffusion test, dan enzyme-linked
immunoabsorbent assay ELISA. Uji latex-agglutination menggunakan antibodi yang dilapisi partikel lateks berwarna yang dapat mengidentifikasi secara cepat
serologis atau isolat kultur murni bakteri. Adanya aglutinasi antaraantibodi dan antigen dapat dibaca secara visual. Uji immunodiffusion dilakukan dengan
meletakkan sampel yang telah diinkubaskan dalam media enrichment pada matriks gel yang telah mengandung antibodi. Adanya antigen pada matriks akan
menyebabkan presipitasi yang terlihat seperti garis. ELISA Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay adalah salah satu metode cepat secara biokimia yang digunakan
sebagai uji imunologi untuk mendeteksi adanya ikatan antara antibodi dengan antigen yang terdapat dalam sampel. Ciri utama teknik ini adalah menggunakan
indikator enzim untuk reaksi imunologi Burgess 1995. Tahapan ELISA diawali coating yaitu adsorbsi secara pasif antibodi pada permukaan padat 96-well
microtiter plate yang terbuat dari polyvinyl chloride atau polystyrene. Protein yang teradsorb pada permukaan plastik mengalami ikatan hydrophobic antara protein
nonpolar dengan matriks plastik. Terjadinya ikatan antibodi pada permukaan plastik tergantung pada perbandingan volume antibodi yang dilarutkan dalam larutan bufer
coating dengan luas permukaan matriks padat, konsentrasi larutan, temperatur, serta waktu inkubasi sehingga dapat ditentukan konsentrasi antibodi yang akan dicoating
Burgess 1995; Crowther 2009. Jika protein yang digunakan untuk coating adalah murni, biasanya digunakan volume 50 µl dengan konsentrasi protein 1-10 µgml
Crowther 2009. Konsentrasi protein yang terlalu tinggi dapat menyebabkan penumpukan dan penebalan lapisan protein sehingga dapat mengganggu interaksi
ikatan protein dengan matrik padat Crowther 2009 Gambar 7. Inkubasi dapat dilakukan pada temperatur 37
o
C selama 1-3 jam atau pada 4
o
C selama semalam.
32
Gambar 7 Konsentrasi protein terlalu tinggi dalam larutan coating
Antibodi yang memiliki spesifitas yang tinggi dapat dikembangkan untuk mendeteksi bakteri yang mengkontaminasi bahan pangan. Terdapat tiga jenis
antibodi yang dapat dikembangkan untuk deteksi, yaitu poliklonal, monoklonal, dan rekombinan Crowther 2009. Pemilihan larutan pencuci dapat juga mempengaruhi
hasil pengujian. Pada umumnya larutan pencuci mengandung deterjen yang digunakan untuk mengurangi reaksi pengikatan non-spesifik Burgess 1995;
Crowther 2009. Antigen merupakan protein yang diinjeksikan pada hewan percobaan sehingga dapat menghasilkan antibodi. Selanjutnya antibodi tersebut
dapat bereaksi secara spesifik dengan antigen yang diuji terdapat dalam sampel. Enzim adalah substansi yang dapat bereaksi pada konsentrasi rendah sebagai katalis
untuk meningkatkan reaksi spesifik, dan mengikat secara langsung ke antibodi. Enzim yang dipilih digunakan sesuai dengan substrat karena tiap enzim biasanya
sepesifik terhadap substrat tertentu. Konjugat merupakan enzim yang dilekatkan pada antibodi, misalnya antiserum kelinci anti IgG tikus dikonjugasikan dengan
horseradish peroxidase Crowther 2009. Substrat adalah bahan kimia yang mampu bereaksi dengan enzim sehingga menghasilkan signal berupa perubahan warna
tertentu sebagai hasil interaksi enzim dengan substrat. Pembacaan hasil ELISA dengan mengukur intensitas perubahan warna yang terjadi menggunakan
spectrophotometer dengan memilih panjang gelombang yang tepat, sesuai dengan warna spesifik yang dihasilkan dari reaksi enzim pada ELISA Burgess 1995.
Uji ELISA terdapat bermacam-macam format. Namun untuk mendeteksi antigen dalam sampel bahan pangan biasanya menggunakan format “sandwich”.
Antibodi dilekatkan pada matriks padat 96 well plate kemudian sampel ditambahkan. Adanya ikatan antibodi dan antigen yang terjadi dapat pantau
menggunakan antibodi sekunder yang telah diikat enzim. Setelah ditambahkan substrat maka ikatan yang telah terjadi tersebut mengalami perubahan warna.
Kategori