2. Ekstrak metanolik adalah ekstrak cair kulit batang apel beludru yang diperoleh dari hasil maserasi dengan pengadukan pada orbital shaker menggunakan
campuran metanol dan air 9:1 dan 1:1 selama satu hari serta telah
dihilangkan kandungan metanolnya.
3. Fraksi etil asetat merupakan hasil fraksi ekstrak metanolik kulit batang apel beludru yang telah difraksinaasi menggunakan petroleum eter kemudian
menggunakan etil asetat. 4. Persen inhibition concentration IC adalah persen yang menyatakan
kemampuan fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru untuk menangkap radikal DPPH.
5. Persen inhibition concentration 50 IC
50
adalah konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru yang menghasilkan penangkapan
50 radikal DPPH.
D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: kulit batang apel beludru yang berasal dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma ,
Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta ; akuades Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Bahan kimia
kualitas pro analitik E.Merck meliputi metanol. Bahan kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA meliputi kuersetin, DPPH , reagen Folin-Ciocalteu, asam
galat. Bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: metanol, petroleum eter , etil asetat.
2. Alat penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa spektrofotometer UV-VIS Shimadzu, vortex Junke Kunkel , corong Buchner, oven,
mikropipet 10-1000 µL; 1-10 mL Acura 825, Socorex, neraca analitik Scaltec SBC 22, BP 160P, vacuum rotary evaporator Junke Kunkel, tabung reaksi
bertutup, ayakan nomor mesh 40, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis Pyrex-Germany dan Iwaki.
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman apel beludru dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma menurut
Morton 1987 dan United States Department of Agriculture NRCS 2013.
2. Pengumpulan dan penyiapan bahan simplisia a. Pengumpulan bahan
Kulit batang apel beludru diperoleh dari kawasan Kampus III Universitas
Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Pemanenan
dilakukan pada bulan Januari 2013 saat pagi hari. Pemanenan kulit batang apel beludru dilakukan dengan cara mengambil kulit batang
bagian dasar pohon, yaitu dari bagian tanah 80-100 cm, kemudian dipotong melintang sepertiga dari
besarnya kulit batang dengan tinggi 10 cm dan jarak pengambilan berikutnya sebesar 20 cm dari tanaman apel beludru dengan kondisi tanaman yang sedang
berbuah dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan,
Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta.
b. Penyiapan bahan simplisia
Sebanyak 200 g kulit batang apel beludru ditimbang, dibersihkan , dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan, kemudian dikeringkan pada oven
dengan suhu 40-60
o
C. Kulit batang yang telah dikeringkan kemudian ditumbuk dan diserbuk menggunakan alat penyerbuk dan diayak dengan ayakan nomor
mesh 40. 3. Ekstraksi simplisia
Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 100 g dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, kemudian ditambah pelarut pertama
berupa campuran metanol : air 9:1 sampai terendam sempurna dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi dengan penggojogan pada orbital shaker pada
suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Ampas
penyaringan dimaserasi dengan pelarut kedua yaitu campuran metanol : air 1:1 selama satu hari, lalu disaring. Filtrat hasil penyaringan pertama dan kedua
digabungkan, kemudian filtrat diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh ekstrak metanolik kulit batang apel beludru.
4. Pembuatan fraksi etil asetat
Ekstrak metanolik kulit batang apel beludru diekstraksi cair-cair menggunakan petroleum eter dengan perbandingan ekstrak cair : petroleum eter
1:1 vv, kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Hasil fraksinasi akan terbenruk dua lapisan, fase air akan berada pada paling bawah, sedangkan fase
petroleum eter berada pada bagian atas. Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi,
yaitu fraksi petroleum eter dan fraksi air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair- cair lagi menggunakan etil asetat dengan perbandingan larutan fraksi air : etil
asetat 1:1 vv sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan, fraksi etil asetat diuapkan dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh
ekstrak kental kemudian dioven selama satu hari sehingga diperoleh ekstrak kering. Lalu hasil fraksi etil asetat tersebut digunakan untuk analisis lebih lanjut.
5. Pembuatan larutan DPPH, pembanding dan uji a. Pembuatan larutan DPPH
Sebanyak 15,9 mg DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup
dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok dan larutan intermediet kuersetin
Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan
mengambil 1 mL dari larutan stok kuersetin dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0
gmL.
c. Pembuatan larutan pembanding
Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin konsentrasi 100,0 gmL kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL,
sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; 15 gmL.
d. Pembuatan larutan uji
1 Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan
metanol p.a 10 mL sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 1000,0 µgmL. Kemudian diambil 1,0 mL dari larutan tersebut kemudian ditambahkan
metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0 gmL.
2 Larutan uji untuk aktivitas antioksidan Sejumlah 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan ditambahkan metanol
p.a sampai 10,0 mL. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan diambil 1 mL stok larutan uji lalu ditambahkan metanol p.a hingga 10,0 mL sehingga diperoleh
larutan deng an konsentrasi 100,0 gmL. Diambil sebanyak 0,75; 1,0; 1,25; 1,5;
1,75 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 gmL.
3 Pembuatan larutan baku asam galat Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang kemudian ditambahkan 10 mL
akuades : metanol p.a 1:1 hingga didapatkan konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 1000,0 µgmL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL larutan
tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a 1:1 sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125;
dan 150 µgmL.
6. Uji pendahuluan a. Uji keberadaan senyawa fenolik
Larutan uji dengan konsentrasi 200,0 gmL dan larutan pembanding
asam galat 150,0 gmL diambil sebanyak 0,5 mL kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades 1:10 vv
ke dalam tabung reaksi lalu didiamkan selama 10 menit. Larutan natrium karbonat 1 M ditambahkan sebanyak 2 mL, kemudian amati warna larutan tersebut.
Bandingkan dengan warna larutan yang berisi air : metanol 1:1 ditambah pereaksi, fraksi etil asetat dan asam galat tanpa diberi pereaksi.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Larutan DPPH diambil sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Larutan DPPH ditambahkan masing-masing
dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 gmL, dan larutan
uji 200,0 gmL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit,
diamati warna pada larutan tersebut. Bandingkan juga dengan warna larutan fraksi etil asetat dan kuersetin tanpa ditambahkan DPPH.
7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini 2007.
a. Penentuan operating time OT
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 gmL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
akuades 1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel
pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 100 gmL dengan waktu pengamatan selama 60 menit.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 gmL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades 1:10
vv. Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama operating time, abso
rbansinya dibaca pada maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.
8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda
batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama operating time, lalu
dilakukan scanning
panjang gelombang
serapan maksimum
dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
b. Penentuan operating time OT
Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan pembanding
kuersetin 5,0; 10,0; 15,0 gmL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex
selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 516 nm selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk
larutan uji 7,5; 12,5; 17,5 gmL.
9. Penetapan kandungan fenolik total a. Pembuatan kurva baku asam galat
S ebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 gmL
ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades 1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium
karbonat 1M. Setelah operating time, absorbansinya dibaca pada maksimum
terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanolik p.a 1:1, reagen Folin- Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan tiga kali.
b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 100 gmL, kemudian dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan
fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat. Dilakukan tiga kali replikasi.
10. Uji aktivitas antioksidan a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH kontrol
Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2 mL larutan DPPH lalu ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca
absorbansinya pada saat operating time dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol
untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi 10 mL kemudian ditambahkan dengan 2 mL larutan pembanding dan uji pada
berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian vortex selama
30 detik dan diamkan selama operating time. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil
optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.
c. Estimasi aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 8a dan 8b, dihitung nilai IC dan IC
50
untuk kuersetin dan fraksi etil asetat kulit batang apel beludru.
F.Analisis Hasil
Aktivitas penangkapan radikal DPPH dihitung dengan rumus : Absorbansi
larutan kontrol
– Absorbansi
sampel larutan pembanding atau uji X 100
Absorbansi
larutan kontrol
Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC
50
mengunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun
pembanding, sedangkan sumbu y adalah IC. Lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC
50
larutan pembanding dan larutan uji.
Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat dalam per g fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier
dengan data kurva baku secara intrapolasi.
Gambar 6. Skema jalannya penelitian
Determinasi tanaman Pengumpulan Bahan
Pembuatan ekstrak metanolik kulit batang apel beludru Ekstraksi cair-cair dengan petroleum eter dan air
Fraksi petroleum eter Fraksi air
Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat
Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
Fraksi air II Uji pendahuluan
Fraksi etil asetat
Analisis stastistik dengan uji R 2.14.1 Estimasi aktivitas antioksidan
Optimasi uji antioksidan
Estimasi kandungan fenolik total
28
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Tanaman
Determinasi merupakan suatu langkah awal dan syarat awal yang harus dilakukan dalam suatu penelitian menggunakan tanaman. Determinasi tanaman
bertujuan untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian serta untuk meminimalisir adanya kesalahan yang terjadi saat
pengambilan sampel untuk analisis fitokimia. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta pada tanggal 31 Mei 2013 dengan acuan Julia F. Morton 1987 dan United States Department of Agriculture NRCS 2013. Pembuktian
determinasi ini diperkuat dengan adanya surat determinasi yang dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta pada lampiran 1 yang menyatakan bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah benar-benar kulit batang apel beludru Diospyros blancoi
A. DC. yang diambil dari tanaman apel beludru.
B. Hasil Pengumpulan Bahan