Deteksi Awal Virus terhadap Umbi Bawang Merah

14 kombinasi ZPT yang terdiri atas 8 kombinasi Tabel 1. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali, sehingga terdapat 24 satuan percobaan. Satu satuan percobaan terdiri atas 4 tabung kultur dan masing-masing tabung ditanam satu eksplan, sehingga setiap kultivar terdapat 96 satuan pengamatan. Tabel 1 Komposisi media untuk pertumbuhan tunas meristem tip bawang merah. Kode Komposisi ZPT M0 – M1 0.25 mg L -1 2ip M2 0.25 mg L -1 BAP M3 0.25 mg L -1 GA 3 M4 0.25 mg L -1 Kinetin M5 0.25 mg L -1 2ip + 0.1 mg L -1 IAA M6 0.25 mg L -1 BAP + 0.1 mg L -1 IAA M7 0.25 mg L -1 Kinetin + 0.1 mg L -1 IAA Keterangan: M0: kontrol

3.2.4 Persiapan Eksplan, Media dan Kondisi Kultur

Persiapan eksplan diawali dengan membuang kulit terluar dan mencuci bersih umbi bawang merah, selanjutnya disterilisasi menggunakan deterjen selama 7 menit sebanyak 2 kali, dan dibilas dengan air mengalir. Umbi direndam dalam larutan 0.04 streptomisin sulfat dan 0.16 mankozeb selama semalam, dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 - 3 kali. Umbi disterilisasi dengan 1.05 NaOCl selama 20 menit. Tahapan selanjutnya dilakukan di Laminar air flow LAF. Umbi dikupas 1 hingga 2 lapisan, kemudian disterilisasi dengan 0.525 NaOCl selama 25 menit. Eksplan dipotong hingga berukuran 0.5 - 1.0 cm dan dikulturkan pada media MS serta diinkubasi selama 1 hari 24 jam. Eksplan yang sudah dikulturkan pada media MS disterilisasi kembali menggunakan 0.263 NaOCl selama 5 menit. Isolasi eksplan meristem tip berukuran kurang dari 1 mm dilakukan di bawah mikroskop binokular dengan bantuan pinset dan jarum diseksi. Eksplan dikulturkan pada media perlakuan Tabel 1 yang mengandung zat pengatur tumbuh ZPT dan tanpa ZPT kontrol serta dengan penambahan 30 g L -1 sukrosa dan 2 g L -1 Gelrite dengan pH 5.8 - 6.0. Eksplan diinkubasi di ruang kultur dengan intensitas cahaya ± 2000 lux selama 24 jam pada suhu 25 ± 1 o C. Setelah perlakuan media selama 3 minggu, eksplan dipindahkan ke media multiplikasi tunas berupa media MS + 2 mg L -1 2-ip + 0.3 mg L -1 GA 3 dan disimpan di ruang kultur dengan kondisi yang sama. Subkultur dilakukan 3-4 minggu sekali sebanyak 3 kali. Tunas yang tumbuh selanjutnya dipindahkan ke media induksi umbi mikro Dinarti 2012, yaitu media MS + vitamin B5 + sukrosa 120 g L -1 dan diinkubasi di ruang kultur dengan intensitas cahaya ± 2000 lux selama 24 jam pada suhu 30 ± 1 o C selama 8 minggu. Planlet umbi lapis mikro dibersihkan dan direndam dalam larutan bakterisida dan fungisida masing-masing 2 g L -1 selama 5 menit dan dikeringkan dengan kertas tisu. Umbi lapis mikro ditanam dalam wadah gelas plastik yang telah diberi media dengan campuran tanah steril, arang sekam dan pupuk kandang 1:1:1. Penyiraman menggunakan media ½ MS dilakukan 2 hari sekali dan pemberian pupuk daun Gandasil D 2 g L -1 dilakukan 1 minggu sekali. Aklimatisasi dilakukan di kotak kasa yang ternaung dari sinar matahari langsung selama 2 - 3 minggu. 15

3.2.5 Pengamatan dan Analisis Data

Pengamatan dilakukan setiap minggu hingga 3 minggu setelah tanam MST. Peubah yang diamati dari percobaan ini meliputi persentase keberhasilan tumbuh eksplan, persentase eksplan berdaun, persentase eksplan berakar, jumlah akar, jumlah tunas, jumlah daun, waktu muncul daun dan tinggi eksplan. Data penelitian dianalisis menggunakan analisis ragam ANOVA untuk mengetahui pengaruh antar perlakuan. Perlakuan yang berpengaruh nyata selanjutnya diuji lanjut menggunakan Duncan’s Multiple Range Test DMRT pada tingkat kepercayaan 95.

3.2.6 Deteksi Virus dengan Metode RT-PCR

Metode RT-PCR pada penelitian ini digunakan untuk mendeteksi virus OYDV pada tanaman bawang merah cv. Bima Brebes dan Tiron hasil kultur in vitro yang telah diaklimatisasi. Tahapan metode RT-PCR meliputi tahapan ekstraksi RNA, sintesis complementary DNA cDNA, amplifikasi cDNA, dan visualisasi hasil amplifikasi.

3.2.6.1 Ekstrasi RNA Total

Ekstraksi RNA secara manual mengikuti metode CTAB Doyle dan Doyle 1987 dengan sedikit modifikasi. Sebanyak 0.1 g sampel daun digerus dengan nitrogen cair, kemudian ditambahkan 500 µl Buffer ekstraksi yang mengandung 1 2- β merkaptoetanol. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL dan diinkubasi dalam penangas air dengan suhu 65 o C selama 30 menit dan setiap 10 menit sekali dibolak-balik untuk membantu proses lisis. Setelah selesai, tabung diangkat dan didiamkan pada suhu ruang selama 2 menit, kemudian ditambahkan 500 μL campuran kloroform : isoamilalkohol 24 : 1. Campuran kemudian divortek dengan kecepatan tinggi selama 5 menit agar menjadi homogen, lalu disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 11 000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil sekitar 400 μL dan dipindah ke tabung baru, kemudian ditambahkan isopropanol sebanyak 267 μL 23 bagian dari campuran. Campuran supernatan selanjutnya dapat disimpan selama semalam atau 1-2 jam pada suhu -80 o C. Setelah itu, campuran supernatan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 11 000 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang, dan pelet yang terbentuk ditambahkan dengan etanol 70 sebanyak 500 μL lalu disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 8 000 rpm. Supernatan dibuang, pelet yang terbentuk dikeringkan selama 15 menit, selanjutnya ditambahkan Buffer TE sebanyak 50 μL.

3.2.6.2 Sintesis Complementary DNA cDNA

RNA total hasil ekstraksi selanjutnya digunakan sebagai template untuk sintesis cDNA. Sintesis cDNA terjadi melalui proses transkripsi balik RNA menggunakan enzim Transcriptase MmuLV Moloney Murine Leukimia Virus. Sintesis cDNA dilakukan dengan mencampurkan 2 μL RNA dan primer Poty 1 sebanyak 0.75 μL mikro serta komponen reaksi lainnya Tabel 2 ke dalam tabung. Selanjutnya DNA disintesis menggunakan mesin Veriti® thermal cycler Applied biosystem dengan satu siklus yang terdiri atas 65 o C 5 menit, 42 o C 60 menit 16 dan 70 o C 10 menit. Produk transkripsi balik berupa cDNA selanjutnya digunakan untuk tahapan amplifikasi. Tabel 2 Komposisi bahan RT-PCR untuk volume reaksi 10 µL. Komponen Volume untuk 1 reaksi μL DTT 50 mM 2.00 Buffer RT 5x 2.00 dNTP 10 mM 1.00 Ribolock 0.50 MmuLV 0.35 Free nuclease water 0.15 Primer Poty 1 1.00 RNA 3.00 Volume total 10.00

3.2.6.3 Amplifikasi cDNA

Tahapan amplifikasi cDNA diawali dengan menyiapkan semua bahan dalam tabung mikro 1.5 ml Tabel 3 dan 4. Untuk kontrol positif digunakan cDNA dari tanaman yang terinfeksi virus. Tabel 3 Komposisi bahan PCR untuk volume satu reaksi 25 µL. Komponen Volume untuk 1 reaksi µL dH 2 9.5 GTG Master mix 12.5 Primer F 10 mM 1.0 Primer R 10 mM 1.0 cDNA 1.0 Volume total 25.0 Tabel 4 Primer yang digunakan untuk amplifikasi virus OYDV pada bawang merah menggunakan metode PCR. Virus target Pasangan primer 5’.......3’ Ukuran DNA targer bp Sumber pustaka OYDV F : CGAAGCAAATTGCCAAGCAG 601 Mahmoud et al. 2007 R : CGATTAGCTGCCCCTCTAAC Keterangan : R : primer Reverse; F : primer Forward Amplifikasi dilakukan sebanyak 1 siklus pada 94 o C selama 3 menit, selanjutnya 35 siklus dengan tahapan denaturasi pada 94 o C selama 30 detik, annealing pada 52 o C selama 1 menit, dan sintesis pada 72 o C selama 1 menit, kemudian khusus untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis 72 o C selama 7 menit. Amplifikasi DNA target dilakukan menggunakan mesin Veriti® thermal cycler Applied biosystem. 3.2.6.4 Visualisasi DNA DNA dielektroforesis pada tegangan 50 volt selama 50 menit menggunakan 1 gel agarosa yang dilarutkan dalam Buffer 0.5x Tris-borate EDTA TBE, kemudian direndam dalam larutam Etidium bromida selama 15-30 menit. Penanda ukuran DNA yang digunakan adalah 1 kb DNA Ladder Thermo scientific.