Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RT-PCR

12

3.1 Pendahuluan

Virus merupakan salah satu masalah yang dianggap penting karena berdampak terhadap menurunnya kualitas dan kuantitas hasil panen Elnagar et al. 2009. Virus dapat menyebar dengan mudah melalui perbanyakan tanaman yang dilakukan secara vegetatif, yaitu menggunakan benih yang terinfeksi virus dan selanjutnya umbi yang tumbuh dapat menjadi inokulum bagi tanaman sehat lainnya Gunaeni et al. 2011. Onion yellow dwarf virus OYDV merupakan virus yang dianggap berbahaya bagi tanaman bawang Brewster 2008. Infeksi OYDV dapat mengurangi bobot umbi dan menurunkan hasil panen yang dapat mencapai 60. Dampak infeksi menjadi lebih parah apabila terdapat infeksi gabungan dengan virus lainya seperti Leek yellow stripe virus Lot et al. 1998. Namun permasalahan tersebut dapat diatasi, salah satunya yaitu dengan cara penggunaan bahan tanam bebas virus Agrios 2002. Penggunan bahan tanam bebas virus dapat meningkatkan hasil panen dan mengurangi dampak negatif dari penanaman umbi yang telah terinfeksi virus kronis Conci et al. 2003. Kultur meristem tip merupakan metode yang umum digunakan untuk mendapatkan tanaman bebas virus. Hal ini didasari oleh asumsi bahwa bagian kubah apikal bebas dari infeksi virus atau mengandung sedikit konsentrasi virus Wang dan Hu 1980. Metode ini telah diaplikasikan oleh Verbeek et al. 1995 dan Taşkin et al. 2013 pada bawang putih dan berhasil mendapat tanaman yang bebas dari OYDV. Kultur meristem tip membutuhkan penambahan zat pengatur tumbuh ZPT agar meristem tip dapat tumbuh dengan optimal. ZPT yang umum digunakan untuk kultur meristem tip, yaitu auksin, sitokinin maupun giberelin Bhojwani dan Dantu 2013. Aplikasi sitokinin 2-ip, BAP, dan kinetin dengan konsentrasi 0.5 - 2.0 mg L -1 dilaporkan dapat menginduksi terjadinya multiplikasi tunas pada meristem tip bawang putih, baik pemberian dalam bentuk kombinasi auksin-sitokinin ataupun sitokinin tunggal Taşkin et al. 2013 ; Gull et al. 2014. Penggunaan GA 3 dilaporkan menghasilkan pada pertumbuhan tunas anyelir yang normal tanpa disertai multiplikasi Ashnayi et al. 2012. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan media dengan kandungan ZPT yang paling baik untuk pertumbuhan tunas meristem tip bawang merah secara in vitro dan mengevaluasi potensi kultur meristem tip dalam mengeliminasi OYDV. 3.2 Bahan dan Metode 3.2.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan 3 dan Labroraturium Mikroteknik, Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB serta Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman IPB, pada bulan Juni 2015 hingga Juni 2016.

3.2.2 Deteksi Awal Virus terhadap Umbi Bawang Merah

Deteksi awal hanya dilakukan pada bawang merah cv. Tiron, karena diasumsikan Bima Brebes telah terinfeksi OYDV yang merujuk pada laporan Wulandari 2016 bahwa umbi yang dideteksi 100 telah terinfeksi virus. Deteksi 13 awal menggunakan umbi Tiron yang diperoleh dari pengiriman ke 2 dari penangkar bawang merah di Kabupaten Bantul. Penanaman umbi dilakukan dengan cara mengambil 100 umbi secara acak dari 2 ikat benih umbi satu ikat benih beratnya ± 2 kg. Ujung umbi dipotong sekitar 13 bagian umbi yang bertujuan untuk mempercepat perkecambahan. Selanjutnya umbi ditanam pada media air selama 2 minggu dengan bantuan styrofom yang telah dilubangi sebagai penyangga umbi. Pengambilan sampel daun dari umbi yang ditanam dilakukan secara acak, yaitu sebanyak 49 dari 100 umbi yang ditanam. Metode DIBA dilakukan berdasarkan metode Mahmood et al. 1997 yang dimodifikasi. Jaringan daun tanaman digerus dalam Tris buffer saline TBS TBS: Tris-HCl 0.02 M dan NaCl 0.15 M, pH 7.5 dengan perbandingan 1 : 10 bv. Cairan daun tersebut kemudian diteteskan pada membran nitroselulosa sebanyak 2 μL. Setelah tetesan sampel mengering, membran direndam dalam 10 mL larutan Blocking non fat milk 2 dalam TBS yang mengandung Triton X-100 dengan konsentrasi akhir 2. Selanjutnya membran diinkubasi pada suhu ruang sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm selama 2 jam menggunakan EYELA Multi shaker MMS. Membran kemudian dicuci 5 kali dengan dH 2 O, setiap pencucian berlangsung 5 menit sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Selanjutnya membran direndam dalam 2 mL TBS yang me ngandung antibodi OYDV 2 μL di tambah Non fat milk dengan konsentrasi akhir 2, membran diinkubasi semalam pada suhu kamar sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm. Membran kemudian dicuci sebanyak 5 kali dengan Tween 0.05 dalam TBS TBST, setiap pencucian berlangsung 5 menit sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Membran direndam dalam 2 mL TBS yang mengandung konjugat 2 μL Goat anti rabbit-IgG Sigma, USA ditambah Non fat milk dengan konsentrasi akhir 2, selanjutnya membran diinkubasi selama 2 jam sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm, yang dilanjutkan pencucian membran dengan TBST sebanyak 5 kali, setiap pencucian berlangsung 5 menit sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Membran direndam dalam larutan campuran Nitro blue tetrazolium NBT 66 μL dan Bromo chloro indolil phosphate BCIP 30 μL yang dicampur dengan 10 mL Buffer substrat Tris-HCl 0.1 M, NaCl 0.1 M dan MgCl 2 5 mM selama 5 - 30 menit. Reaksi positif akan ditandai dengan terjadinya perubahan warna putih menjadi ungu pada membran nitroselulosa yang telah ditetesi cairan daun tanaman dan reaksi dapat dihentikan dengan mencuci membran dengan dH 2 O, dan selanjutnya dikeringkan. Menurut Kadwati 2013, persentase infeksi virus dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : jumlah sampel terinfeksi Persentase infeksi virus = --------------------------------- x 100 jumlah sampel yang diuji 3.2.3 Rancangan Penelitian Percobaan dilaksanakan secara terpisah pada dua kultivar bawang merah, yaitu Bima Brebes dan Tiron. Umbi bibit yang digunakan telah mengalami dua bulan penyimpanan dan diperoleh dari petani penyedia bibit bawang merah di Kabupaten Brebes dan Bantul. Rancangan percobaan disusun berdasarkan rancangan kelompok lengkap teracak RKLT dalam faktor tunggal, yaitu 14 kombinasi ZPT yang terdiri atas 8 kombinasi Tabel 1. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali, sehingga terdapat 24 satuan percobaan. Satu satuan percobaan terdiri atas 4 tabung kultur dan masing-masing tabung ditanam satu eksplan, sehingga setiap kultivar terdapat 96 satuan pengamatan. Tabel 1 Komposisi media untuk pertumbuhan tunas meristem tip bawang merah. Kode Komposisi ZPT M0 – M1 0.25 mg L -1 2ip M2 0.25 mg L -1 BAP M3 0.25 mg L -1 GA 3 M4 0.25 mg L -1 Kinetin M5 0.25 mg L -1 2ip + 0.1 mg L -1 IAA M6 0.25 mg L -1 BAP + 0.1 mg L -1 IAA M7 0.25 mg L -1 Kinetin + 0.1 mg L -1 IAA Keterangan: M0: kontrol

3.2.4 Persiapan Eksplan, Media dan Kondisi Kultur

Persiapan eksplan diawali dengan membuang kulit terluar dan mencuci bersih umbi bawang merah, selanjutnya disterilisasi menggunakan deterjen selama 7 menit sebanyak 2 kali, dan dibilas dengan air mengalir. Umbi direndam dalam larutan 0.04 streptomisin sulfat dan 0.16 mankozeb selama semalam, dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 - 3 kali. Umbi disterilisasi dengan 1.05 NaOCl selama 20 menit. Tahapan selanjutnya dilakukan di Laminar air flow LAF. Umbi dikupas 1 hingga 2 lapisan, kemudian disterilisasi dengan 0.525 NaOCl selama 25 menit. Eksplan dipotong hingga berukuran 0.5 - 1.0 cm dan dikulturkan pada media MS serta diinkubasi selama 1 hari 24 jam. Eksplan yang sudah dikulturkan pada media MS disterilisasi kembali menggunakan 0.263 NaOCl selama 5 menit. Isolasi eksplan meristem tip berukuran kurang dari 1 mm dilakukan di bawah mikroskop binokular dengan bantuan pinset dan jarum diseksi. Eksplan dikulturkan pada media perlakuan Tabel 1 yang mengandung zat pengatur tumbuh ZPT dan tanpa ZPT kontrol serta dengan penambahan 30 g L -1 sukrosa dan 2 g L -1 Gelrite dengan pH 5.8 - 6.0. Eksplan diinkubasi di ruang kultur dengan intensitas cahaya ± 2000 lux selama 24 jam pada suhu 25 ± 1 o C. Setelah perlakuan media selama 3 minggu, eksplan dipindahkan ke media multiplikasi tunas berupa media MS + 2 mg L -1 2-ip + 0.3 mg L -1 GA 3 dan disimpan di ruang kultur dengan kondisi yang sama. Subkultur dilakukan 3-4 minggu sekali sebanyak 3 kali. Tunas yang tumbuh selanjutnya dipindahkan ke media induksi umbi mikro Dinarti 2012, yaitu media MS + vitamin B5 + sukrosa 120 g L -1 dan diinkubasi di ruang kultur dengan intensitas cahaya ± 2000 lux selama 24 jam pada suhu 30 ± 1 o C selama 8 minggu. Planlet umbi lapis mikro dibersihkan dan direndam dalam larutan bakterisida dan fungisida masing-masing 2 g L -1 selama 5 menit dan dikeringkan dengan kertas tisu. Umbi lapis mikro ditanam dalam wadah gelas plastik yang telah diberi media dengan campuran tanah steril, arang sekam dan pupuk kandang 1:1:1. Penyiraman menggunakan media ½ MS dilakukan 2 hari sekali dan pemberian pupuk daun Gandasil D 2 g L -1 dilakukan 1 minggu sekali. Aklimatisasi dilakukan di kotak kasa yang ternaung dari sinar matahari langsung selama 2 - 3 minggu.