16 dan 70
o
C 10 menit. Produk transkripsi balik berupa cDNA selanjutnya digunakan untuk tahapan amplifikasi.
Tabel 2 Komposisi bahan RT-PCR untuk volume reaksi 10 µL.
Komponen Volume untuk 1 reaksi
μL DTT 50 mM
2.00 Buffer RT 5x
2.00 dNTP 10 mM
1.00 Ribolock
0.50 MmuLV
0.35 Free nuclease water
0.15 Primer Poty 1
1.00 RNA
3.00 Volume total
10.00
3.2.6.3 Amplifikasi cDNA
Tahapan amplifikasi cDNA diawali dengan menyiapkan semua bahan dalam tabung mikro 1.5 ml Tabel 3 dan 4. Untuk kontrol positif digunakan cDNA
dari tanaman yang terinfeksi virus. Tabel 3 Komposisi bahan PCR untuk volume satu reaksi 25 µL.
Komponen Volume untuk 1 reaksi µL
dH
2
9.5 GTG Master mix
12.5 Primer F 10 mM
1.0 Primer R 10 mM
1.0 cDNA
1.0 Volume total
25.0
Tabel 4 Primer yang digunakan untuk amplifikasi virus OYDV pada bawang merah menggunakan metode PCR.
Virus target
Pasangan primer 5’.......3’
Ukuran DNA targer bp
Sumber pustaka OYDV
F : CGAAGCAAATTGCCAAGCAG 601
Mahmoud et al. 2007
R : CGATTAGCTGCCCCTCTAAC
Keterangan : R : primer Reverse; F : primer Forward
Amplifikasi dilakukan sebanyak 1 siklus pada 94
o
C selama 3 menit, selanjutnya 35 siklus dengan tahapan denaturasi pada 94
o
C selama 30 detik, annealing pada 52
o
C selama 1 menit, dan sintesis pada 72
o
C selama 1 menit, kemudian khusus untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis 72
o
C selama 7 menit. Amplifikasi DNA target dilakukan menggunakan mesin Veriti® thermal
cycler Applied biosystem. 3.2.6.4 Visualisasi DNA
DNA dielektroforesis pada tegangan 50 volt selama 50 menit menggunakan 1 gel agarosa yang dilarutkan dalam Buffer 0.5x Tris-borate EDTA TBE,
kemudian direndam dalam larutam Etidium bromida selama 15-30 menit. Penanda ukuran DNA yang digunakan adalah 1 kb DNA Ladder Thermo scientific.
17 Visualisasi DNA dilakukan di bawah UV Transluminator dan didokumentasikan
dengan kamera digital.
3.3 Hasil dan Pembahasan
Pertumbuhan awal meristem tip pada 1 MST menunjukkan adanya respon pertumbuhan berupa pemanjangan primordia daun dan pembengkakan pada bagian
cakram umbi basal plate. Keberhasilan tumbuh eksplan dilihat dari kemampuan eksplan untuk tumbuh dan membentuk daun. Persentase tumbuh eksplan Bima
Brebes yang paling tinggi diperoleh dari perlakuan kinetin M4 serta kombinasi 2- ip dan IAA M5, dengan persentase tumbuh yang mencapai 100 Gambar 4.
Sementara itu, persentase tumbuh eksplan yang paling rendah 58 terdapat pada perlakuan GA
3
M3 serta kombinasi kinetin dan IAA M7. Persentase eksplan tumbuh yang paling tinggi pada Tiron yaitu 91 terdapat pada perlakuan BAP
M2 dan kombinasi kinetin dengan IAA M7.
Rata-rata persentase eksplan Bima Brebes dan Tiron yang mengalami gagal tumbuh masing-masing sebesar 19 dan 28. Kegagalan pertumbuhan eksplan
yang diisolasi dari meristem tip 0.6 - 1.0 mm bawang putih sebesar 29 juga dilaporkan Verbeek et al. 1995. Gagalnya eksplan yang tumbuh tidak disebabkan
oleh media, akan tetapi dipengaruhi oleh kontaminasi, perlukaan akibat isolasi eksplan, maupun akibat proses sterilisasi.
Eksplan yang tumbuh rata-rata mulai terbentuk daun pada 1 hingga 2 MST Tabel 5. Waktu munculnya daun yang paling cepat terlihat pada eksplan Tiron
yang dikulturkan pada media tanpa ZPT kurang dari 2 minggu. Pembentukan daun dapat dipengaruhi oleh aktivitas sitokinin dalam menginduksi pembelahan sel.
Eksplan meristem tip yang dikulturkan diduga memiliki sitokinin endogen yang cukup untuk dapat menginduksi pembelahan sel dan menginisiasi pembentukan
daun pada meristem. Sementara itu, eksplan yang mengalami defisiensi sitokinin saat pertumbuhan meristem akan memberikan pengaruh yang sebaliknya dan
menyebabkan terhentinya diferensiasi sel daun Werner et al. 2003 .
Eksplan Bima Brebes berhasil tumbuh dan dapat membentuk daun, sedangkan persentase berdaun eksplan Tiron 13 lebih rendah dari Bima Brebes
Gambar 5. Analisis statistik terhadap kultivar Tiron menunjukkan bahwa perlakuan ZPT tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap persentase eksplan
berdaun. Gambar 4 Persentase eksplan tumbuh dua kultivar bawang merah pada 3 MST.
20 40
60 80
100 120
140
M0 M1
M2 M3
M4 M5
M6 M7
E k
sp lan
tu m
b u
h
Media Bima Brebes
Tiron M0 = Kontrol
M1 = 0.25 mg L
-1
2-ip M2 = 0.25 mg L
-1
BAP M3 = 0.25 mg L
-1
GA
3
M4 = 0.25 mg L
-1
kinetin M5 = 0.25 mg L
-1
2-ip + 0.1 mg L
-1
IAA M6 = 0.25 mg L
-1
BAP + 0.1 mg L
-1
IAA M7 = 0.25 mg L
-1
kinetin + 0.1 mg L
-1
IAA
