Isolat diinkubasi pada suhu 27 C selama 48 jam. Hasil inkubasi diamati di bawah
mikroskop pada perbesaran 100 kali, 200 kali dan 400 kali, kemudian difoto.
3.3.10. Kromatografi Lapis Tipis KLT
Plat KLT dipotong berbentuk persegi panjang dengan ukuran 10 cm x 1 cm. Potongan plat diberi tanda nama kode isolat pada bagian atas dan tanda titik
untuk penotolan ekstrak pada bagian bawah. Sampel ekstrak dengan konsentrasi 10 µgµl dan 20 µgµl ditotolkan menggunakan tip pipet pada plat
KLT sebanyak 15 µl 3 x 15 µl. Setelah itu sampel dikromatografi dengan eluen tertentu dalam wadah elusi tertutup.
Eluen yang digunakan adalah etil asetat, metanol dan butanol dengan variasi perbandingan 100:0, 75:25, 50:50, 25:75 dan 0 :100. Setelah
dikromatografi, plat dikeringkan dan diamati di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Bercak yang terbentuk, digambar dengan pensil dan dihitung R
f
-nya.
3.3.11. Uji Bioautografi Bakteri Patogen
Bakteri yang digunakan dalam uji bioautografi ini adalah Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Langkah-langkah yang dilakukan
dalam uji ini adalah : 1.
Pembuatan Kultur Bakteri Uji
Bakteri-bakteri uji diinokulasikan ke dalam 60 ml media NB masing-masing sebanyak satu ose. Media tersebut diinkubasi dengan shaking incubator 150
rpm, suhu 28 C selama 24 jam.
2. Pengujian
Setiap bakteri uji Bacillus subtillis sebanyak 900 µl, Eschericia coli sebanyak 100 µl dan Staphylococcus aureus sebanyak 200 µl ditambahkan ke dalam
media NA steril 50 C, sehingga kerapatan bakteri dalam media sebanyak ± 1
x 10
6
CFUml. Cara perhitungan koloni dapat dilihat pada lampiran 6. Media yang telah ditambahkan bakteri uji tersebut dikocok supaya merata, kemudian
dituang ke dalam petri persegi panjang dan dibiarkan memadat .
Plat KLT hasil kromatografi yang sudah ditandai dan dihitung nilai R
f
-nya ditempelkan ditekan dengan hati-hati pada permukaan media NA yang berisi
bakteri uji. Plat tersebut diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 C selama 48
jam. Selesai inkubasi, zona hambat yang terbentuk diamati dan diukur diameternya menggunakan jangka sorong.
3.3.12. Uji Bioautografi Khamir Patogen
1. Pembuatan Kultur Candida albicans
Candida albicans diinokulasikan ke dalam 20 ml media PDB masing-masing sebanyak satu ose. Media tersebut diinkubasi dengan shaking incubator 150
rpm, suhu 28 C selama 3 hari.
2. Pengujian
Candida albicans sebanyak 400 µl ditambahkan ke dalam media PDA steril suhu 50
C, sehingga kerapatan Candida albicans dalam media sebanyak ± 1 x 10
6
CFUml. Cara perhitungan koloni dapat dilihat pada lampiran 6. Media
yang telah ditambahkan khamir uji tersebut dikocok supaya merata, kemudian dituang ke dalam petri persegi panjang dan dibiarkan memadat.
Plat KLT hasil kromatografi yang sudah ditandai dan dihitung nilai R
f
-nya ditempelkan ditekan dengan hati-hati pada permukaan media PDA yang
berisi bakteri uji. Plat tersebut diinkubasi dalam inkubator pada suhu 27 C
selama 48 jam. Selesai inkubasi, zona hambat yang terbentuk diukur diameternya menggunakan jangka sorong.
3.3.13. Uji Bioautografi Fungi Patogen
