kali masing-masing 5 µl. Paper disc yang telah ditetesi ekstrak, dikeringkan di atas plat kaca. Setelah kering, paper disc tersebut diletakkan di atas media
PDA padat berisi khamir uji. Paper disc kontrol positif nystatin dan kontrol negatif metanol dan etil asetat masing-masing juga diletakkan pada media
PDA padat berisi khamir uji. Inkubasi dilakukan pada suhu 28 C selama 24-48
jam. Setelah inkubasi, zona hambat yang terbentuk diukur diameternya dengan jangka sorong.
3.3.7. Uji Aktivitas Bioassay Antifungi
1. Pengenceran dan Perhitungan Spora Aspergillus niger
Larutan tween sebanyak 3 ml disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 C,
tekanan 1 atm selama 15 menit. Larutan tween steril dipipet sebanyak 1 ml ke dalam kultur Aspergillus niger yang ditumbuhkan pada media PDA slant.
Spora Aspergillus niger digores sampai terlepas dari agar menggunakan tip pipet. Spora tersebut diencerkan secara berseri sampai pengenceran 10
-3
menggunakan 1 ml sampel dan 9 ml air steril sebagai diluent.
2. Pengujian
Aspergillus niger sebanyak 800 µl ditambahkan ke dalam media PDA 50 C
sehingga kerapatan Aspergillus niger sesuai dalam media sebanyak ± 1 x 10
6
CFUml. Cara perhitungan koloni dapat dilihat pada lampiran 6. Media yang telah ditambahkan spora A. niger dikocok supaya merata, kemudian dituang ke
dalam petri persegi panjang dan dibiarkan memadat.
Larutan ekstrak dengan konsentrasi 10 µgml dan 20 µgml masing-masing diteteskan ke permukaan paper disc sebanyak 15 µl mengandung ekstrak
sampel 150 µg sampai 300 µg. Penetesan tersebut dilakukan sebanyak tiga kali masing-masing 5 µl. Paper disc yang telah ditetesi ekstrak, dikeringkan
di atas plat kaca. Setelah kering, paper disc tersebut diletakkan di atas media PDA padat berisi fungi uji. Paper disc kontrol positif nystatin dan kontrol
negatif metanol dan etil asetat masing-masing juga diletakkan pada media PDA padat berisi fungi uji. Inkubasi dilakukan pada suhu 28
C selama 48 jam. Setelah inkubasi, zona hambat yang terbentuk diukur diameternya dengan
jangka sorong.
3.3.8. Perhitungan Jumlah Sel Mikroba Patogen
3.3.8.1. Pengenceran dan Metode
Total Plate Count TPC
Kultur bakteri dan khamir uji masing-masing dikocok dengan vortex mixer. Kultur yang telah dikocok tersebut, diambil 1 ml dan dituang ke dalam 9
ml air steril. Kultur diencerken secara berseri dari pengenceran 10
-1
sampai pengenceran 10
-8
. Hasil pengenceran 10
-5
sampai 10
-8
ditumbuhkan pada media NA plate untuk bakteri dan PDA plate untuk khamir, dan setiap pengenceran
dilakukan secara duplo. Bakteri dan khamir dituang ke dalam media NA dan PDA secara pour plate, setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37
C selama 24 jam untuk bakteri dan 28
C selama 24-48 jam untuk khamir Fardiaz, 1993. Penghitungan jumlah koloni yang terbentuk hanya pada rentang 25 sampai
250 koloni. Kerapatan koloni dihitung dengan rumus :
CFUml = Jumlah koloni Volume mikroba yang ditumbuhkan x pengenceran
Setelah diketahui kerapatan koloni dalam 1 ml media, maka dilakukan perhitungan untuk mengetahui jumlah mikroba yang akan ditambahkan ke dalam
media uji. Rumusnya adalah : CFUml media = jumlah mikroba yang diperoleh × faktor pengenceran
volume media
3.3.8.2. Metode Direct Cell Number Count
Jumlah sel Aspergillus niger dihitung dengan metode Direct Cell Number Count menggunakan haemocytometer. Satu tetes spora A. niger diteteskan pada
haemocytometer kemudian haemocytometer ditutup dengan cover glass. Haemacytometer tersebut diletakkan di atas mikroskop dan diamati pada
perbesaran 200 kali. Jumlah spora A. niger dihitung secara acak hanya pada 10 kotak dari 25 kotak berukuran sedang yang ada dalam hemacytometer. Hasil
perhitungan dijumlahkan dan dimasukkan dalam rumus : SporaUnit = Jumlah spora x faktor koreksi penggunaan kotak sampel x
haemocytometer grid x faktor pengenceran
SporaUnit = Jumlah spora x 2,5 x 10
4
x 10
2
Jumlah spora yang dituang ke dalam media uji dihitung menggunakan rumus : Sporaml media = jumlah sporaunit x faktor pengenceran
Volume media 3.3.9.
Identifikasi Morfologi Metode Slide Culture
Identifikasi kapang endofit dilakukan dengan pengamatan secara makroskopis dan mikroskopis. Secara makroskopis dilakukan dengan cara
mengamati warna dan bentuk permukaan koloni kapang yang ditumbuhkan dalam media agar. Secara mikroskopis identifikasi dilakukan dengan menggunakan
metode Slide Culture Atlas et al, 1984. Tahapan metode Slide Culture yaitu : kertas saring diletakkan pada dasar
cawan petri steril kemudian dibasahi dengan aquadest steril. Kaca objek dimasukkan ke dalam cawan petri tersebut dan cover glass diletakkan disamping
kaca objek, setelah itu cawan petri tersebut ditutup. Media PDA sebanyak 10 ml 0,39 gram dalam aquadest 10 ml
disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Media PDA steril
dituang ke dalam cawan petri kecil, kemudian dibiarkan memadat. Agar tersebut dilubangi menggunakan sedotan steril satu tusukan. Bulatan agar diambil
menggunakan tusuk gigi steril. Agar tersebut diletakkan di atas kaca objek, kemudian dibelah menjadi dua bagian. Satu bagian sisi agar dibuang. Pada satu
bagian sisi agar lainnya diinokulasikan kapang endofit TlU1 atau TlU2. Kaca penutup objek diletakkan di atas potongan agar, kemudian cawan petri ditutup.
Isolat diinkubasi pada suhu 27 C selama 48 jam. Hasil inkubasi diamati di bawah
mikroskop pada perbesaran 100 kali, 200 kali dan 400 kali, kemudian difoto.
3.3.10. Kromatografi Lapis Tipis KLT
Plat KLT dipotong berbentuk persegi panjang dengan ukuran 10 cm x 1 cm. Potongan plat diberi tanda nama kode isolat pada bagian atas dan tanda titik
untuk penotolan ekstrak pada bagian bawah. Sampel ekstrak dengan konsentrasi 10 µgµl dan 20 µgµl ditotolkan menggunakan tip pipet pada plat
KLT sebanyak 15 µl 3 x 15 µl. Setelah itu sampel dikromatografi dengan eluen tertentu dalam wadah elusi tertutup.
Eluen yang digunakan adalah etil asetat, metanol dan butanol dengan variasi perbandingan 100:0, 75:25, 50:50, 25:75 dan 0 :100. Setelah
dikromatografi, plat dikeringkan dan diamati di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Bercak yang terbentuk, digambar dengan pensil dan dihitung R
f
-nya.
3.3.11. Uji Bioautografi Bakteri Patogen
