E. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan seri larutan baku PPD
a. Pembuatan larutan natrium metabisulfit 0,01 M. Sejumlah lebih
kurang 1,9 g natrium metabisulfit ditimbang seksama lalu dilarutkan dalam akuades yang telah disaring dengan kertas Whatman hingga 1 L.
b. Pembuatan larutan stok PPD 2 mgmL dan larutan intermediet PPD 40
gmL. Larutan stok PPD 2 mgmL dibuat dengan menimbang seksama lebih kurang 100 mg baku PPD lalu dilarutkan dengan larutan natrium metabisulfit 0,01
M dan diencerkan hingga batas dalam labu takar 50 mL. Larutan intermediet PPD 40
gmL dibuat dari larutan stok 2 mgmL. c.
Pembuatan seri larutan baku PPD. Seri larutan baku dibuat dari larutan intermediet dengan konsentrasi 40
gmL sebanyak tujuh seri konsentrasi yaitu 1, 2, 3, 4, 6, 8, dan 10
gmL.
2. Optimasi jenis fase diam, fase gerak, suhu oven, dan laju alir KCKT
Masing-masing seri larutan baku PPD dengan konsentrasi 1, 2, 3, 4, 6, 8, dan 10
gmL diinjeksikan ke dalam KCKT dengan volume 20 µL. Optimasi pemisahan sistem KCKT dilakukan pada setiap kolom yang tertera pada Tabel I
dengan mengubah kondisi suhu oven kolom, komposisi dan laju alir fase gerak seperti yang ditunjukkan pada Tabel II. Nilai TF, Rs, N, HETP, dan tR ditetapkan
dari data kromatogram yang dihasilkan untuk masing-masing perlakuanoptimasi. Contoh penyiapan fase gerak asetonitril:air = 10:90 pH 8 adalah dengan
mencampur air akuades sebanyak 90 mL yang telah ditambah larutan amonia 10 sebanyak 100 µ L dengan asetonitril sebanyak 10 mL. Fase gerak tersebut
disaring menggunakan kertas saring Whatman dengan dibantu pompa vakum lalu di-degassing dengan ultrasonifikator selama 20 menit.
Tabel II. Kondisi sistem KCKT yang diubah-ubah dalam optimasi
Komposisi fase gerak dalam berbagai pH
Air Metanol
Asetonitril Asam asetat 0,05 M
Metanol:air Asetonitril:air
Asetonitril:metanol:air
Laju alir mLmenit 0,5
0,6 0,8
0,9 1
Suhu oven ºC Suhu lingkungan 32-33
34 36
40 45
48
Pengubahan pH fase gerak dilakukan dengan menambahkan dapar fosfat 0,15 M, amonia 10, asam asetat 0,05 M atau asam formiat. Dapar fosfat 0,15 M
dibuat dengan menimbang seksama lebih kurang 57,731 g Na
2
HPO
4
dan 35,3833 g KH
2
PO
4
lalu dilarutkan dalam akuades hingga 1 L.
3. Uji kesesuaian sistem KCKT
Kategori