UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.2.2.2 Media Pertumbuhan Mikroba
a. Medium yang digunakan untuk isolasi dan pemurnian isolat kapang endofit yaitu: Potato Dextrose Agar PDA Merck.
b. Medium yang digunakan untuk kultivasi dan fermentasi isolat kapang endofit
yaitu: Potato Dextrose Yeast PDY. c. Medium yang digunakan untuk kultur dan pertumbuhan bakteri yaitu: Nutrient
Agar NA Merck. d. Medium yang digunakan untuk seleksi kapang endofit dan yaitu: uji aktivitas
antibakteri yaitu: Mueller Hinton Agar MHA Oxoid.
3.2.2.3 Bahan untuk Sterilisasi Permukaan
Air mengalir, larutan natrium hipoklorit NaOCl 5,25 Baycline, etanol 70, dan akuades steril.
3.2.2.4 Bahan Uji Aktivitas Antibakteri
a. Bakteri uji: Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 Gram positif dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Gram negatif.
b. Bahan pewarnaan Gram : Kristal Violet 0,5, cairan lugol, etanol 96, safranin.
c. Antibiotik: Kloramfenikol. d. Bahan pengenceran inokulum: NaCl 0,9.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Sterilisasi Alat dan Bahan Kharisma, 2012
Alat-alat yang tidak tahan pemanasan dengan suhu tinggi seperti erlenmeyer, tabung reaksi bertutup, gelas ukur dan media pertumbuhan dilakukan sterilisasi
dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Alat-alat yang terbuat dari gelas seperti cawan petri, beaker glass dan alat gelas lainnya yang tidak
presisi disterilkan menggunakan oven pada suhu 160°C-170°C selama 1-2 jam, sementara itu alat-alat logam dapat disterilkan dengan cara dipijarkan
menggunakan api spirtus Kumar, 2012.
3.3.2 Pembuatan Media
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.2.1 Potato Dextrose Agar PDA
Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan media PDA Merck, ditimbang PDA sebanyak 39 g kemudian ditambahkan 1000 mL akuades, lalu
dihomogenkan dengan menggunakan magnetik stirer dan dipanaskan diatas hot plate. Media disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121°C,
tekanan 1 atm. Media dituang secara aseptis ke dalam cawan petri steril masing- masing cawan ± 10 mL dan dibiarkan hingga memadat.
3.3.2.2 Potato Dextrose Agar PDA Agar Miring
Media PDA agar miring dibuat dengan cara timbang sebanyak 39 g PDA Merck kemudian ditambahkan 1000 mL akuades, lalu dihomogenkan dengan
menggunakan magnetik stirer dan dipanaskan diatas hot plate. Campuran media tersebut dimasukkan secara aseptis ke dalam tabung reaksi masing-masing
sebanyak 5 mL lalu disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 1 atm selama 15 menit, tabung reaksi tersebut diletakkan dalam posisi miring ± 45° dan
agar dibiarkan hingga memadat Jauhari, 2010.
3.3.2.3. Nutrient Agar NA
Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan media NA Merck dibuat dengan cara bubuk NA sebanyak 20 g dilarutkan dengan 1000 mL akuades. Media
tersebut dicampur hingga homogen dengan cara pengadukan dan pemanasan dengan hot plate dan stirer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam autoklaf
pada suhu 121°C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Media dituang secara aseptis ke dalam cawan petri steril masing-masing 10 mL dan biarkan hingga memadat.
3.3.2.4 Nutrient Agar NA Agar Miring
Media NA agar miring dibuat dengan cara timbang sebanyak 20 g NA Merck dilarutkan dengan 1000 mL akuades. Media tersebut dicampur hingga homogen
menggunakan magnetic stirer dan pemanasan di atas hot plate. Campuran media dimasukkan secara aseptis ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 mL
lalu disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 1 atm selama 15 menit, tabung reaksi tersebut diletakkan dalam posisi miring ± 45° dan dibiarkan hingga
memadat Jauhari, 2010.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.2.5 Potato Dextrose Yeast PDY
Media PDY dibuat dengan cara ditimbang sebanyak 200 g kentang yang telah dikupas dan dibersihkan, ditambahkan 500 mL akuades, kemudian dipanaskan
hingga mendidih sekitar 15 menit. Ekstrak kentang disaring, kemudian ditambahkan Dextrose sebanyak 22 g dan Yeast Extract 4,4 g, campuran diaduk
hingga homogen. Setelah larutan dingin ditambahkan akuades sampai 1000 mL. Selanjutnya media PDY dimasukkan ke dalam botol fermentasi sebanyak 250 mL
kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit
Maryanti, 2015. 3.3.2.6
Mueller Hinton Agar MHA
Pembuatan media MHA Oxoid dibuat dengan cara ditimbang sebanyak 37 g bubuk MHA, ditambahkan 1000 mL akuades, kemudian dihomogenkan dengan
menggunakan magnetik stirer dan dipanaskan di atas hot plate. Media disterilisasi
menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit Suciatmih, 2008. 3.3.3 Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Kapang Endofit
Sterilisasi permukaan dilakukan denagn cara daun tanaman Iler Coleus atropurpureus Benth. diambil pada bagian tertentu, yaitu bagian daun yang
terletak pada ujung batang daun muda dengan kode DIM, tengah batang daun sedang dengan kode DIS, dan pangkal batang daun tua dengan kode DIT dicuci
bersih menggunakan air mengalir, selanjutnya direndam dalam etanol 70 selama 1 menit dilanjutkan dalam larutan natrium hipoklorit 5.25 selama 5 menit dan
direndam kembali dengan etanol 70 selama 30 detik, dan sampel daun dibilas menggunakan akuades steril selama 1 menit untuk menghilangkan sisa agen
sterilisasi permukaan. Daun Iler yang sudah disterilisasi kemudian diletakkan di atas kertas saring steril hingga kering Kalyanasundaram dkk, 2015. Daun
Selanjutnya dipotong dengan ukuran 1x1 cm
2
menggunakan gunting steril Wahyudi P. Hendriana M., 2003. Proses isolasi kapang endofit dilakukan
dengan cara potongan daun dengan ukuran 1x1 cm
2
yang sudah steril ditanam di atas permukaan media PDA steril di dalam cawan petri. Media yang telah ditanami
dengan sampel daun selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang 27-29 ⁰C selama 5
sampai 21 hari Rustanti, 2007. Cawan petri kemudian disimpan dalam box plastik
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang diberi kapur barus untuk menghindari kontaminasi serangga kecil. Skema cara kerja sterilisasi permukaan dan isolasi kapang endofit dapat dilihat pada lampiran
3.
3.3.4 Pemurnian Isolat Kapang Endofit
Kategori