16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.6.2. Media Hetrotrof HTR Cair
Media HTR cair dibuat dengan cara mencampur pepton 3,75 gram, K
2
HPO
4
0,625, glukosa 0,625 gram, NaCl 1,25 gram dan tripton 0,75 gram, kemudian dilarutkan dengan pemanasan dalam 250 mL aquadest. Selanjutnya disterilisasi
menggunakan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit.
3.3.7. Purifikasi dan Karakterisasi Bakteri pada Media Luria Bertani Agar
Hasil karakterisasi bakteri Staphylococcus aureus kemudian dipurifikasi dimurnikan. Teknik yang digunakan adalah Streak Plate. Jarum ose dipanaskan
terlebih dahulu sampai berpijar, lalu didinginkan. Kemudian bakteri diambil dan digoreskan pada media luria bertani agar. Selanjutya diinkubasi pada suhu 37
C selama 24 jam Deby et al., 2012. Kemudian dilakukan pengamatan secara
morfologis terhadap bakteri Staphylococcus aureus yang telah ditumbuhkan pada media luria bertani agar, serta dilakukan karakterisasi bakteri dengan pewarnaan
Gram.
3.3.8. Pembuatan Suspensi Bakteri Staphylococcus aureus
Diambil sebanyak satu ose bakteri Staphylococcus aureus yang telah dibiakkan dan dimasukkan ke dalam tabung berisi media heterotrof HTR
sebanyak 10 mL dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Kultur bakteri uji
divorteks kemudian diukur nilai optical dencity OD pada panjang gelombang 600nm untuk mengetahui konsentrasi dari suspensi bakteri tersebut. Kemudian
suspensi bakteri diencerkan mengunakan media HTR hingga OD mencapai 0.5.
3.3.9. Uji Pembentukan dan Pertumbuhan Biofilm Optimal
Uji pembentukan biofilm dilakukan dengan menggunakan 10 mL suspensi bakteri dalam tabung reaksi yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
C. Jika terbentuk biofilm terlihat lapisan-lapisan seperti benang halus pada suspensi
bakteri. Selanjutnya dilakukan uji pertumbuhan biofilm untuk mengetahui waktu inkubasi yang menghasilkan pertumbuhan biofilm Staphylococcus aureus paling
baik. Pengujian dilakukan dengan menggunakan microtitier flat-bottom
17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
polystyrene 96 wells, dengan cara memvariasikan waktu inkubasinya. Jumlah suspensi bakteri yang dimasukkan adalah 200 µL dengan variasi waktu inkubasi
adalah 1, 2, 3, dan 4 hari. Setelah masa inkubasi, microplate dicuci menggunakan air mengalir sebanyak 3 kali, kemudian ditambahkan 200 µL larutan kristal violet
1 ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Microplate dicuci kembali dengan cara yang sama seperti sebelumnya, yaitu dengan air
mengalir sebanyak 3 kali. Larutan etanol 96 sebanyak 200 µL dimasukkan ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Pebacaan Optical
Dencity OD dilakukan dengan Mark Bio-Rad microplate reader pada panjang gelombang 595nm. Pengujian dilakukan triplo. Hasil absorbansi terbesar pada
waktu inkubasi dan jumlah bakteri tersebut dinyatakan memiliki pembentukan biofilm yang optimal George, 2011.
3.3.10. Uji Aktivitas Antibiofilm Secara In Vitro Yosephine, 2013
Uji Pencegahan Pembentukan Biofilm pada Permukaan
Uji ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas air perasan jeruk nipis terhadap pencegahan pembentukan biofilm Staphylococcus aureus. Pengujian dilakukan
dengan menggunakan microtitier flat-bottom polystyrene 96 wells. Pengujian dilakukan terhadap masing-masing ekstrak tanaman dengan variasi konsentrasi
0.0625, 0,125, 0,25, 0,50, 1, 2, 4 dan 8 vv. 200 µL ekstrak tanaman terlebih dahulu dimasukkan pada tiap well dan diinkubasi selama 1 jam,
kemudian ekstrak tanaman dibuang lalu dimasukkan suspensi bakteri sebanyak 200 µL pada tiap well. Suspensi uji kemudian diinkubasi selama 2 hari pada suhu
37 C. Setelah masa inkubasi, microplate dicuci menggunakan air mengalir
sebanyak 3 kali, kemudian ditambahkan 200 µL larutan kristal violet 1 ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Microplate dicuci kembali
dengan cara yang sama seperti sebelumnya, yaitu dengan air mengalir sebanyak 3 kali. Larutan etanol 96 sebanyak 200 µL dimasukkan ke tiap well dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Pebacaan Optical Dencity OD dilakukan dengan Mark Bio-Rad microplate reader pada panjang gelombang
595nm. Pengujian dilakukan triplo. pencegahan =
Kategori