1. Pengembangan Metode Penetapan Kadar Siklamat
Percobaan pengembangan metode penetapan kadar siklamat dilakukan berbasis instrumen KCKT dan dilaksanakan dalam dua tahap
yaitu pengembangan fase gerak KCKT dan pengembangan metode ekstraksi siklamat dari matriks pangan. Pada pengembangan fase gerak
KCKT, yang menggunakan bufer fosfat dan metanol, diterapkan perlakuan pengubahan rasio fase gerak untuk memperoleh pemisahan siklamat yang
optimal. Sebagai indikator adalah waktu retensi t
R
, faktor kapasitas k’, dan resolusi R. Untuk pengembangan metode ekstraksi digunakan
prosedur ekstraksi cair-cair dengan suatu modifikasi yaitu mengubah kondisi pH larutan sampel hingga pH 1 untuk menghasilkan tingkat
ekstraksi siklamat yang optimal. Parameter keberhasilan ekstraksi adalah koefisien distribusi K
D
, rasio distribusi nilai D dan persen terekstrak E. Bagan alir bagian ini dapat dilihat pada Gambar 2.
Model pangan Na-siklamat Standar siklamat
Dilarutkan dalam air
Na
+
+ [siklamat]
-
sistem KCKT + H
2
SO
4
hingga pH 1 komposisi fase gerak bufer fosfat –
[H-siklamat]
aq
metanol 75:25, 80:20, 85:15 ekstraksi dengan pelarut organik
optimasi puncak dan luas area [H-siklamat]
org
Metode terpilih Gambar 2 Bagan alir pengembangan metode penetapan kadar siklamat
a Penentuan Fase Gerak KCKT 1 Spesifikasi KCKT
Prosedur Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan mode fase terbalik ini mempunyai spesifikasi sebagai berikut:
Kolom : Oktadesilsilane RP-18, ukuran partikel 5 μm, dimensi 250 mm x 4.6 mm ID
Spesifikasi : HPLC Shimadzu Prominence LC-20AD
Fase gerak : Bufer fosfat KH
2
PO
4
pH 4.6 : Metanol
Laju aliran : 1 mlmenit
Tekanan : 75–78 kgfcm
3
Detektor : UV-Vis 200 nm; suhu oven 40
C LC mode
: low pressure; tipe isokratik Volume penyuntikan : 20 μl
2 Rasio Fase Gerak Pada kromatografi fasa terbalik yang menggunakan fase gerak
polar, untuk menghasilkan pemisahan siklamat polar, kepolaran sistem fase gerak diatur sedemikian rupa sehingga siklamat dapat
terelusi. Dalam komposisi fase gerak bufer fosfat dan metanol, hal ini dilakukan dengan mengubah-ubah rasio metanol. Perlakuan rasio fase
gerak yang dilakukan adalah bufer fosfat KH
2
PO
4
:Metanol = 75:25, 80:20, 85:15. Kondisi optimal yang diinginkan mengacu pada prinsip
pemisahan sebaik mungkin dengan waktu analisis seminimal mungkin Zhu et al. 2005. Percobaan optimasi fase gerak dilakukan dengan
larutan standar siklamat. 3 Pengamatan
- Waktu retensi komponen yang diamati t
R
- Waktu retensi komponen tidak ditahan t
m
- Faktor kapasitas k’ : t
R
- t
m
t
m
- Resolusi R b Pengembangan Metode Ekstraksi
Proses ekstraksi dalam analisis siklamat ini terutama ditujukan untuk menghilangkan berbagai komponen pangan seperti pati, protein,
lipida, pewarna dan sebagainya, sehingga memudahkan analisis selanjutnya dengan KCKT. Dalam sistem ekstraksi cair-cair, siklamat
terdapat sebagai fase cairan dan sebagai fase organik adalah eter. Selama ekstraksi, terjadi perpindahandistribusi siklamat dari fase cairan ke fase
organik. 1 Pembuatan Model Pangan
Untuk keperluan percobaan pengembangan metode ekstraksi dibuat tiga macam model pangan yang mewakili bentuk pangan yaitu
pangan cair minuman ringan, semi padat pudingagar, dan pangan padat roti. Proses pembuatan model pangan sebagai berikut:
i Minuman Ringan Ningrum, 2005 Dimasukkan 25 g sukrosa 10, 250 mg benzoat 0.1, dan 250
mg asam askorbat 0.1 dalam 250 ml air kemudian diaduk merata. Dipanaskan hingga 80
C selama 10 menit, sambil ditambahkan 250 mg Na-siklamat sehingga diperoleh konsentrasi
1,000 mgl 250 miligram siklamat dalam 250 mililiter larutan. Selanjutnya larutan disaring kemudian dimasukkan botol gelap dan
kedap udara. ii Pudingagar Ningrum, 2005
Duapuluh empat gram 12 gula dilarutkan dalam 200 ml air. Kemudian dimasukkan 1.4 g bubuk agar 0.7 dan 320 mg Na-
siklamat konsentrasi 1,600 mgl, lalu dipanaskan hingga mendidih. Setelah didinginkan hingga suhu sekitar 60
C dan penambahan sedikit flavor serta pewarna, lalu dimasukkan cetakan
dan disimpan di wadah gelap serta kedap cahaya. iiiRoti
Limapuluh gram telur 20 bersama 75 g gula pasir 30 dikocok merata, lalu dimasukkan 75 g tepung terigu 30 sedikit
demi sedikit sambil ditambahkan 50 g air 20. Adonan diaduk hingga kalishomogen, lalu dimasukkan 500 mg Na-siklamat
sehingga konsentrasi 2,000 mgkg 500 miligram dalam 250 gram
adonan. Selanjutnya adonan dituang ke cetakan lalu dikukus hingga matang.
2 Ekstraksi Cair-Cair Sejumlah 20–25 gram atau mililiter sampel model pangan
ditimbang, dimasukkan gelas piala 100 ml dan ditambah ± 50 ml air kemudian diaduk hingga homogen [Vo]. Kemudian ditambah larutan
H
2
SO
4
10 hingga pH 1. Selanjutnya dimasukkan corong pemisah, ditambah 20–25 ml
eter, kemudian dikocokdigoyang kira-kira 20 kali hingga terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan eter diatas, sampel dibawah. Pengocokan dapat
dibantu dengan shaker selama 15 menit. Cairan eter sangat volatil mudah menguap sehingga tiap kali habis mengocok hendaknya
tutupkran corong pemisah dibuka hati-hati untuk mengeluarkan uap. Lapisan eter dipisahkan dari fraksi cairan sampel dan dicuci 2
kali setiap kali dengan 10 ml air. Untuk membantu pembentukan lapisan, ditambahkan 20 ml NaCl jenuh untuk menghindari
emulsifikasi. Air cucian dikumpulkan bersama fraksi cairan sampel kemudian ekstraksi diulangi kembali 2 kali, setiap kali dengan 20–25
ml eter dan dishaker 15 menit. Ekstrak eter hasil tiap kali ekstraksi dikumpulkan pada gelas
piala 100 ml, lalu diuapkan fraksi eternya sampai hampir kering. Selanjutnya sisa penguapan dilarutkan dalam pelarut metanol dan
ditetapkan hingga tanda tera pada labu takar 50 ml [V
E
]. Larutan ini sudah berfungsi sebagai larutan uji dan siap diinjeksikan ke instrumen
KCKT. 3 Uji Kualitatif Identifikasi
Uji kualitatif siklamat umumnya dilakukan dengan metode sodium nitrite test AOAC, 1999, tetapi dalam penelitian ini
identifikasi dilakukan sekaligus dengan instrumen KCKT. Sebelumnya ditentukan terlebih dahulu nilai LOD Limit of Detection. LOD adalah
konsentrasi terkecil suatu senyawa yang dapat terdeteksi secara
kualitatif WHO, 1985; Snyder, 1997. Penentuan nilai LOD berdasarkan prosedur kalibrasi.
Prosedur uji kualitatif dengan KCKT dilakukan berdasarkan hasil pengembangan komposisi fase gerak KCKT, yang diperoleh
sebagai berikut: Kolom : Oktadesilsilane
RP-18, ukuran
partikel 5 μm, dimensi 250 mm x 4.6 mm ID
Fase gerak : Larutan KH
2
PO
4
pH 4.6 : Metanol 85
: 15
Laju aliran :
1 mlmenit Volume penyuntikan : 20 μl
Detektor :
UV-Vis, 200 nm Keberadaan siklamat ditentukan dengan membandingkan
waktu retensi sampel yang diduga mengandung siklamat dengan waktu retensi standar siklamat Wasik Buchgraber, 2007. Jika sampel
menghasilkan puncak dengan waktu retensi disekitar waktu retensi standar siklamat maka dapat diduga sampel pangan tersebut positif
mengandung siklamat. 4 Uji KuantitatifPengukuran Konsentrasi Siklamat
Sebelum dilakukan pengukuran konsentrasi siklamat, perlu ditetapkan terlebih dahulu nilai LOQ Limit of Quantification, yaitu
konsentrasi terkecil suatu senyawa yang dapat ditentukan secara kuantitatif WHO, 1985; Snyder, 1997. Nilai LOQ suatu instrumen
perlu diketahui untuk menentukan konsentrasi terendah senyawa yang terdapat dalam sampel yang bisa diukur oleh instrumen tersebut.
Penentuan nilai LOQ didasarkan seperti prosedur kalibrasi. Untuk persiapan kalibrasi dibuat larutan baku induk dengan
cara melarutkan 1.0423 g standar siklamat pada pelarut metanol hingga volume 100 ml, sehingga diperoleh konsentrasi 10,423 mgl
ppm. Adapun sebagai larutan uji digunakan cairan hasil ekstraksi. Sebanyak 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 ml larutan baku induk
dipipet dan dimasukkan dalam labu takar 50 ml, kemudian diencerkan
dengan metanol sampai tanda tera sehingga diperoleh serangkaian larutan baku kerja seperti tertera di Tabel 5. Selanjutnya larutan baku
kerja disaring dengan membran filter 0.45 um dan dihampaudarakan dengan ultrasonic bath, sebelum siap diinjeksikan.
Tabel 5 Penyiapan larutan baku kerja untuk pengukuran siklamat pada sampel model pangan
No.
Volume labu takar, V
1
ml
Volume pengambilan baku induk, V
2
ml
a
Konsentrasi baku kerja, M
1
mgl
b
1 50
1 208.46
2 50
2 416.92
3 50
3 625.38
4 50
4 833.84
5 50
5 1,042.30
6 50
6 1,250.76
7 50
7 1,459.23
8 50
8 1,667.68
a Konsentrasi baku induk M
2
= 10,423 mgl
b M
1
= V
2
x M
2
V
1
Larutan baku kerja dan larutan uji masing-masing disuntikkan secara terpisah kedalam instrumen KCKT yang telah dicapai kondisi
optimalnya. Urutan injeksi dimulai dari larutan baku kerja konsentrasi terendah ke konsentrasi tinggi, kemudian dilanjutkan dengan larutan
uji. Dari serangkaian larutan baku kerja dibuat kurva kalibrasi
dengan memplot peak area pada sumbu y dengan konsentrasi pada sumbu x. Kemudian dibuat garis lurus berdasar persamaan y = ax + b,
dimana a adalah slope dan b nilai intersep yang memotong sumbu y Wasik Buchgraber, 2007. Jika kurva menunjukkan garis lurus,
maka persamaan garis kurva kalibrasi dapat digunakan untuk perhitungan konsentrasi siklamat pada cairan ekstrak.
Respon kromatogram yang diukur adalah peak area siklamat dalam cairan ekstrak Wasik Buchgraber, 2007. Apabila peak area
pada ekstrak melebihi peak area tertinggi larutan baku kerja maka dilakukan pengenceran terhadap cairan ekstrak kemudian hasil
pengenceran dianalisis kembali.
Kadar siklamat ditentukan dengan mengintegrasi peak area larutan uji pada persamaan kurva kalibrasi. Konsentrasi siklamat cairan
ekstrak dihitung dengan persamaan: Wasik Buchgraber, 2007 R – b
Ce = ........ 5
a dimana : R = peak area respon siklamat
a = slope b = intersep
Ce = konsentrasi siklamat pada cairan ekstrak mgl Adapun perhitungan kadar siklamat pada sampel menggunakan
rumus : mg Ce x V
1
x V
3
mg x l x ml [S]
= .....6
kg M x V
2
l x kg x ml Ce = konsentrasi siklamat pada ekstrak, hasil persamaan 5
M = berat sampel yang diambil untuk ekstraksi kg V
1
= volume larutan hasil ekstraksi, misal 0.05 l V
2
= volume larutan ekstrak untuk pengenceran, misal 10 ml V
3
= volume akhir hasil pengenceran, misal 50 ml 5 Pengamatan Parameter Ekstraksi
- [S]
E
: konsentrasi siklamat dalam fase organik - [S]
O
: konsentrasi siklamat dalam fase cair - pH
: indikator kertas pH - [V]
E
: volume akhir fase pengekstrak - [V]
O
: volume awal sampel - Koefisien Distribusi K
D
: [S]
E
[S]
O
- Rasio Distribusi D : K
D
{1+K
a
[H
+
]} Siklamat terekstrakterdistribusi ke dalam fase organik jika nilai D
mendekati nilai K
D
. - Persen terekstrak E: {[S]
E
V
E
[S]
E
V
E
+ [S]
O
V
O
} x 100 Kriteria E adalah 95–105 untuk analit sejumlah 1,000 mgkg
Swartz Krull, 1997.
2. Kajian Paparan Siklamat
Kategori