26
C. METODE PENELITIAN
Dalam pelaksanaannya, penelitian ini dibagi dalam dua tahapan, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian lanjutan. Tahapan penelitian secara
keseluruhan dapat dilihat pada Lampiran 1.
1. Penelitian pendahuluan
a. Penghitungan jumlah mikroba uji pada umur 24 jam Metode
Hitungan Cawan Penghitungan jumlah mikroba uji pada umur 24 jam bertujuan untuk
mengetahui jumlah sel dari satu ose kultur mikroba, setelah ditumbuhkan selama 24 jam dalam 10 ml Nutrient Broth. Setelah diketahui jumlah sel
mikroba dalam 10 ml Nutrien Broth, dapat ditentukan pengenceran yang perlu dilakukan untuk memperoleh sekitar 10
5
sel per ml media agar. Kultur dari agar miring digores sebanyak satu ose dan dimasukkan
ke dalam 10 ml NB steril, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Setelah waktu inkubasi tercapai, diambil 1 ml dan dipindahkan ke
dalam 9 ml NB steril kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Setelah waktu inkubasi tercapai, diambil 1 ml dan dipindahkan ke dalam 9
ml larutan pengencer steril. Seri pengenceran dibuat dari 1:10
1
, 1:10
2
, 1:10
3
hingga 1 : 10
8
. Pada pengenceran ke-5, pengenceran ke-6, pengenceran ke-7 dan pengenceran
ke-8, diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril kemudian dituang agar. Agar digoyang pelan supaya sel mikroba menyebar rata di
dalam agar. Setelah agar membeku, diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam. Setelah waktu inkubasi tercapai, dilakukan penghitungan jumlah
mikroba. Proses persiapan kultur mikroba secara rinci dapat dilihat pada Lampiran 2.
b. Ekstraksi komponen antimikroba secara ekstraksi tunggal
Tahap ini bertujuan untuk mengekstrak komponen antimikroba yang terdapat dalam biji jintan hitam. Ekstrak yang ingin diperoleh dari proses
ekstraksi tunggal adalah ekstrak air, ekstrak etanol dan minyak atsiri. Ekstrak air dan ekstrak etanol akan diperoleh dari proses ekstraksi
27 menggunakan pelarut dengan metode refluks, sedangkan minyak atsiri
akan diperoleh dari proses distilasi uap. Proses ekstraksi menggunakan pelarut air dan pelarut etanol dilakukan di Laboratorium Kimia Pangan,
Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor, sedangkan destilasi uap dilakukan di Balai Tanaman Rempah dan Obat Balitro, Bogor.
Setelah diperoleh ekstrak air, ekstrak etanol dan minyak atsiri, masing-masing ekstrak akan diuji aktivitas antimikrobanya dengan metode
difusi agar terhadap bakteri Staphylococus aureus, Escherichia coli, Salmonella
Typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, dan Bacillus cereus. Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antimikroba yang baik, yaitu
memiliki spektrum yang luas dan nilai diameter penghambatan yang besar, akan diuji lanjut dengan penentuan nilai Minimum Inhibitory
Concentration MIC dan diidentifikasi komponen fitokimianya.
Metode refluks dilakukan dengan mengkontakkan bahan secara langsung dengan pelarut, yaitu dengan memasukkan bahan dan pelarut ke
dalam tabung refluks. Sebelum tabung refluks yang berisi bahan dan pelarut dipasang pada alat refluks, alat refluks dipanaskan mendekati suhu
titik didih pelarut. Untuk pelarut air, alat refluks dipanaskan hingga mendekati suhu 100
o
C 98-99
o
C, sedangkan untuk pelarut etanol alat refluks
dipanaskan hingga mendekati suhu 70
o
C 68-69
o
C. Pada saat suhu yang diinginkan sudah tercapai, tabung refluks yang
berisi bahan dan pelarut dipasang pada alat refluks. Pelarut akan mengekstrak komponen antimikroba dari bahan. Pada saat titik didih
pelarut tercapai, pelarut akan menguap. Untuk mengurangi kehilangan pelarut, kondensor dipasang di atas tabung refluks. Dengan demikian, saat
pelarut yang menguap melewati kondensor yang dingin, pelarut tersebut akan jatuh kembali ke dalam tabung refluks.
Ekstraksi dengan metode refluks ini dilakukan dua kali. Ekstraksi pertama dilakukan selama 3 jam, sedangkan ekstraksi kedua dilakukan
selama 2 jam. Setelah waktu ekstraksi pertama tercapai 3 jam, tabung refluks
diangkat dan cairan yang diperoleh disaring dengan kertas saring dan dituang ke dalam botol. Ampas dimasukkan kembali ke dalam tabung
28 refluks
untuk diekstrak kedua kalinya. Ampas ditambah pelarut dengan jumlah yang sama seperti pada ekstraksi pertama. Tabung refluks dipasang
kembali pada alat refluks dan dioperasikan selama 2 jam. Setelah waktu refluks
tercapai, cairan yang diperoleh disaring dan digabungkan dengan filtrat pertama.
Bahan yang digunakan dalam ekstraksi pertama dalam keadaan kering, sedangkan bahan yang digunakan pada ekstraksi kedua masih
mengandung sebagian pelarut yang tersisa setelah ekstraksi pertama. Ratio bahan dan pelarut pada ekstraksi pertama adalah 1:3. Jumlah pelarut yang
ditambahkan pada ekstraksi kedua sama dengan jumlah pelarut yang ditambahkan pada ekstraksi pertama sehingga ratio bahan dan pelarut pada
ekstraksi kedua tidak tepat 1:3. Setelah proses refluks selesai dilakukan dua kali, filtrat yang
diperoleh dikurangi jumlah pelarutnya dengan cara diuapkan menggunakan rotavapor. Untuk filtrat air, penguapan pelarut dilakukan
pada suhu 50
o
C, sedangkan untuk filtrat etanol, penguapan pelarut dilakukan pada suhu 40-45
o
C. Setelah di-rotavapor, sebagian pelarut masih tertinggal dalam ekstrak sehingga dilakukan penghembusan gas N
2
untuk menguapkan seluruh pelarut. Penghembusan gas N
2
dilakukan hingga ekstrak mencapai berat stabil, yaitu pengurangan bobot ekstrak
kurang dari 0,001 g. Ekstrak yang diperoleh kemudian disimpan pada suhu kurang dari 4
o
C suhu refrigerator. Air sangat sulit diuapkan seluruhnya dari ekstrak. Walaupun telah di-
rotavapor pada suhu 50
o
C dan dihembus gas N
2
, belum semua kandungan air dalam ekstrak menguap. Setelah dihembus gas N
2
selama kurang lebih 3 jam, tidak diperoleh pengurangan bobot ekstrak yang cukup berarti. Oleh
karena itu, khusus untuk ekstrak air, ekstrak yang digunakan tidak benar- benar pekat. Untuk mengetahui kepekatan ekstrak air secara kuantitatif,
dilakukan pengukuran kadar air. Bagan proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut air dapat dilihat pada Gambar 8, sedangkan bagan
proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut etanol dapat dilihat pada Gambar 9.
29
Ulangan
Direfluks dengan air 100
o
C, 3 jam
100 ºC, 2 jam
` Dipekatkan 50
o
C
Dihembus N
2
Disimpan dalam refrigerator suhu 4
o
C hingga proses analisis
Gambar 8. Diagram proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut air
Ulangan
Direfluks dengan etanol 70
o
C, 3 jam
70 ºC, 2 jam
` Dipekatkan 40-45
o
C
Dihembus N
2
Disimpan dalam refrigerator suhu 4
o
C hingga proses analisis
Gambar 9. Diagram proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut etanol
Ampas Filtrat
Ekstrak etanol Bubuk jintan hitam
Ampas Filtrat
Ekstrak air Bubuk jintan hitam
Ekstrak etanol pekat
30
2. Penelitian Lanjutan
Kategori