38
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebelum dilakukan uji aktivitas antimikroba, dilakukan penghitungan jumlah sel mikroba pada umur 24 jam agar terdapat jumlah sel mikroba yang
sama pada setiap cawan. Senyawa antimikroba yang terdapat di dalam ekstrak biji jintan hitam diperoleh dengan cara distilasi uap, ekstraksi tunggal menggunakan
air dan etanol serta ekstraksi bertingkat menggunakan pelarut organik dengan tingkat kepolaran berbeda. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi bertingkat
adalah heksan teknis, etil asetat teknis, dan metanol teknis. Bahan yang diekstrak secara bertingkat menggunakan pelarut organik adalah biji jintan hitam yang telah
dihilangkan minyak atsirinya. Ekstrak yang diperoleh dari proses distilasi uap adalah minyak atsiri,
sedangkan ekstrak yang diperoleh dari ekstraksi tunggal menggunakan pelarut adalah ekstrak air dan ekstrak etanol. Ekstrak yang diperoleh dari ekstraksi
bertingkat menggunakan pelarut adalah ekstrak heksan, ekstrak heksan-etil asetat, dan ekstrak heksan-etil asetat-metanol. Ekstrak heksan-etil asetat selanjutnya
disebut sebagai ekstrak etil asetat dan ekstrak heksan-etil asetat-metanol selanjutnya disebut sebagai ekstrak metanol. Pada masing-masing ekstrak tersebut
dilakukan uji aktivitas antimikroba menggunakan metode difusi agar. Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antimikroba dengan spektrum luas, akan diuji nilai
Minimum Inhibitory Concentration MIC terhadap bakteri tertentu dan
diidentifikasi secara kualitatif komponen fitokimia-nya.
A. PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA PADA UMUR 24 JAM
Penghitungan jumlah mikroba dilakukan terhadap semua kultur mikroba yang digunakan dalam penelitian ini. Metode yang digunakan adalah metode
hitungan cawan. Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup pada medium agar, sel tersebut akan
berkembang biak membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop Fardiaz, 1992. Dengan
menggunakan metode hitungan cawan, jumlah sel mikroba yang digunakan dapat diketahui dengan lebih pasti karena yang dihitung adalah sel yang
39 memang benar-benar masih hidup. Berikut ini adalah hasil penghitungan
jumlah sel bakteri uji pada umur 24 jam.
Tabel 7.
Jumlah sel mikroba pada umur 24 jam Jenis mikroba
Jumlah mikroba umur 24 jam Bacillus cereus
5.3 x 10
8
Staphylococcus aureus 1.2 x 10
8
Esherichia coli 4.5 x 10
8
Salmonella Typhimurium
5.4 x 10
8
Pseudomonas aeruginosa 1.2 x 10
8
Dari Tabel 7, dapat diketahui bahwa jumlah sel masing-masing mikroba pada umur 24 jam adalah sekitar 10
8
selml NB. Jumlah mikroba yang diinginkan untuk dimasukkan ke dalam agar NA adalah 10
5
selml agar sehingga perlu dilakukan pengenceran hingga 11000 kali. Cara penentuan
jumlah mikroba yang dimasukkan ke dalam agar NA dapat dilihat pada Lampiran 4.
B. KARAKTERISTIK BAHAN BAKU
Biji jintan hitam yang digunakan berwarna hitam, berbentuk bulat lonjong, dengan panjang sekitar 2 mm dan tebal sekitar 1 mm. Biji jintan hitam
memiliki aroma yang khas jintan hitam dan rasanya pahit. Biji jintan hitam mengandung kadar karbohidrat dan lemak yang tinggi seperti terlihat pada
Tabel 8 berikut ini.
Tabel 8.
Hasil analisis proksimat biji jintan hitam Komposisi
Persentase Air
5.52 Protein
19.69 Lemak
31.68 Abu
4.28 Karbohidrat
38.83
C. KARAKTERISTIK EKSTRAK JINTAN HITAM
Proses ekstraksi senyawa antimikroba dilakukan dengan metode ekstraksi tunggal dan ekstraksi bertingkat. Ekstraksi tunggal untuk
memperoleh senyawa antimikroba dari jintan hitam dilakukan dengan distilasi
40 uap dan ekstraksi menggunakan pelarut air dan etanol. Distilasi uap dilakukan
untuk memperoleh hanya komponen volatil biji jintan hitam, yaitu dalam bentuk minyak atsiri. Ekstraksi tunggal dengan air dan etanol dimaksudkan
untuk mengekstrak komponen volatil dan komponen non-volatil yang terdapat dalam biji jintan hitam. Ekstraksi bertingkat dilakukan terhadap biji jintan
hitam yang telah diambil minyak atsirinya, menggunakan heksan, etil asetat, dan metanol secara berurutan.
Proses ekstraksi dengan pelarut, baik ekstraksi tunggal maupun ekstraksi bertingkat dilakukan dengan metode refluks, yaitu dengan mengkontakkan
langsung bahan dan pelarut. Dalam metode refluks, campuran bahan dan pelarut diberi panas mendekati titik didih pelarut. Proses ekstraksi dilakukan
dua kali agar jumlah yang rendemen diperoleh dapat optimal. Ekstraksi pertama dilakukan selama 3 jam, sedangkan ekstraksi kedua dilakukan selama
2 jam. Filtrat dari masing-masing proses digabungkan kemudian dipekatkan dan dihembus gas N
2
untuk menghilangkan pelarut yang terbawa dalam filtrat sehingga diperoleh ekstrak pekat tanpa residu pelarut. Pengecualian untuk
ekstrak air, pelarut air tidak diuapkan seluruhnya. Proses ekstraksi secara bertingkat dilakukan untuk memisahkan senyawa
antimikroba secara lebih spesifik berdasarkan polaritasnya. Menurut Adawiyah 1998, ekstrak yang diperoleh dengan ekstraksi secara bertingkat
memberikan aktivitas antimikroba yang lebih baik dibandingkan dengan ekstraksi tunggal. Ekstrak hasil ekstraksi bertingkat memiliki aktivitas
antimikroba yang lebih baik karena senyawa antimikroba akan terpisah sesuai dengan polaritas pelarutnya sehingga konsentrasi senyawa antimikroba pada
masing-masing pelarut akan lebih tinggi. Penyulingan minyak atsiri distilasi uap dilakukan dua kali dengan
menggunakan biji jintan hitam yang berbeda dan ulangan yang berbeda juga. Pada penyulingan pertama dilakukan tanpa penghalusan biji jintan hitam
karena dianggap sudah cukup halus, sedangkan pada penyulingan yang kedua dilakukan dengan penghalusan biji jintan hitam. Dari penyulingan pertama
diperoleh minyak atsiri dengan rendemen sebesar 0.16 vw, sedangkan dari penyulingan kedua diperoleh minyak atsiri dengan rendemen sebesar
41 0.34 vw. Rendemen yang diperoleh pada penyulingan minyak atsiri bahan
bakunya dihaluskan terlebih dahulu ternyata lebih tinggi daripada rendemen penyulingan minyak atsiri yang bahan bakunya tidak dihaluskan. Terjadi
perubahan besar rendemen yang cukup besar, yaitu dua kali lipat dari rendemen yang pertama. Hasil penyulingan minyak atsiri secara lebih rinci
dapat dilihat pada Tabel 9.
Tabel 9.
Hasil penyulingan minyak atsiri biji jintan hitam Sampel
Bobot bahan yang disuling
kg Kadar air
Ukuran mesh
Rendemen vw
1 1.90 12.97 10
0.16 2 0.92 2.50
20 0.34
Keterangan : Laporan hasil uji dapat dilihat pada Lampiran 6 dan Lampiran 7.
Peningkatan rendemen pada minyak atsiri jintan hitam yang telah dihaluskan disebabkan oleh proses penghalusan akan meningkatkan luas
permukaan bahan sehingga minyak atsiri akan lebih mudah terekstrak. Bila bahan dibiarkan utuh, minyak atsiri hanya dapat diekstraksi jika uap air
berhasil melalui jaringan tanaman dan mendesaknya ke permukaan. Hal ini terjadi secara difusi. Jika bahan dihaluskan, ukuran ketebalan untuk terjadinya
proses difusi akan berkurang sehingga saat penyulingan, laju penguapan minyak atsiri dari bahan menjadi lebih cepat Ketaren, 1987.
Selain disebabkan oleh perbedaan perlakuan, peningkatan rendemen minyak atsiri dapat juga disebabkan oleh kadar air jintan hitam yang disuling.
Jintan hitam yang dihaluskan terlebih dulu sebelum disuling memiliki kadar air 2.50 lebih rendah daripada kadar air jintan hitam yang disuling tanpa
dilakukan penghalusan 12.97 . Menurut Ketaren 1987, penyulingan minyak atsiri tidak sempurna jika bahan mengandung kadar air tinggi. Pada
penelitian ini, minyak atsiri yang diuji aktivitas antimikrobanya adalah minyak atsiri yang diperoleh dari biji jintan hitam yang dihaluskan terlebih dulu.
Komponen antimikroba yang akan diekstrak dari biji jintan hitam belum diketahui sifatnya. Oleh karena itu, dilakukan ekstraksi kembali secara
bertingkat pada ampas hasil penyulingan minyak atsiri. Ekstraksi bertingkat
42 dilakukan menggunakan berbagai pelarut organik dengan polaritas yang
berbeda-beda. Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi bertingkat adalah heksan, etil asetat, dan metanol. Heksan sebagai pelarut yang bersifat non
polar, etil asetat sebagai pelarut yang bersifat semi polar dan metanol sebagai pelarut yang bersifat polar. Senyawa antimikroba akan terekstrak sesuai
polaritas pelarutnya sehingga senyawa antimikroba yang terdapat dalam jintan hitam akan terpisah berdasarkan kepolarannya.
Ekstraksi tunggal dan ekstraksi bertingkat menggunakan pelarut, dilakukan dengan metode refluks pada suhu mendekati titik didih pelarutmya
dalam keadaan murni bukan titik didih pelarut teknis. Titik didih air, etanol murni, heksan murni, etil asetat murni dan metanol murni pada tekanan 1
atmosfir secara berturut-turut adalah 100
o
C, 78
o
C, 69
o
C, 77-78
o
C, dan 65
o
C. Penggunaan suhu tinggi dalam ekstraksi akan meningkatkan kelarutan komponen karena suhu tinggi akan mempermudah penetrasi pelarut ke dalam
struktur selular bahan Houghton dan Raman, 1998. Komponen yang terekstrak dengan metode refluks merupakan komponen yang tahan panas. Hal
ini terkait dengan termostabilitas komponen, komponen yang tidak tahan panas akan hilang selama proses refluks.
Pelarut etanol, heksan, etil asetat dan metanol yang digunakan dalam ekstraksi merupakan pelarut bersifat teknis. Pemilihan pelarut teknis ini terkait
dengan pertimbangan ekonomis jika akan diaplikasikan dalam industri. Pelarut yang paling mudah diperoleh dan paling murah adalah air karena air
tersedia melimpah di muka bumi. Selain itu, air merupakan pelarut bagi semua sistem kehidupan, digunakan oleh manusia dalam memasak dan menyiapkan
makanan sehingga residunya tidak memiliki pengaruh toksik terhadap tubuh manusia.
Ekstrak air sangat sulit dipekatkan jika dibandingkan dengan ekstrak etanol, ekstrak heksan, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol. Pemekatan
ekstrak air dilakukan menggunakan rotavapor pada suhu 50
o
C, sedangkan ekstrak yang lain dipekatkan pada suhu 40-45
o
C. Pemekatan ekstrak air tidak dilakukan pada suhu yang lebih tinggi lagi dengan tujuan untuk menghindari
kerusakan komponen dalam ekstrak. Walaupun dipekatkan pada suhu yang
43 lebih tinggi daripada ekstrak lainnya, pemekatan tetap masih sulit dilakukan.
Hal ini diduga disebabkan oleh ke-vakum-an alat yang digunakan kurang baik. Semakin rendah tekanan udara alat semakin vakum maka titik didih pelarut
akan semakin rendah. Tekanan vakum alat yang digunakan cukup untuk mencapai titik didih etanol, heksan, etil asetat dan metanol pada suhu 40
o
C, tetapi tidak cukup vakum untuk mencapai titik didih air. Ekstrak air berwarna
coklat susu dan masih ada aroma jintan hitam. Rendemen ekstrak air adalah 82.73 , tetapi tidak berupa ekstrak pekat. Kadar air dari ekstrak air adalah
86.85 . Karakteristik ekstrak yang dihasilkan dapat dilihat pada Tabel 10.
Tabel 10. Karakteristik berbagai ekstrak jintan hitam
Ekstrak Rendemen
Penampakan Warna
Aroma Ekstraksi tunggal :
• Minyak atsiri • Ekstrak air
• Ekstrak etanol 0.34
82.73 8.39
Coklat jernih Coklat susu
Coklat kehitaman Menyengat, khas
jintan hitam Ada aroma jintan
hitam Ada aroma jintan
hitam Ekstraksi bertingkat :
• Ekstrak heksan • Ekstrak heksan-
etil asetat • Ekstrak heksan-
metanol 25.55
8.60 5. 08
Coklat kehijauan, agak keruh
Coklat tua Coklat tua
Tidak ada aroma jintan hitam
Tidak ada aroma jintan hitam
Tidak ada aroma jintan hitam
Keterangan : Rendemen = Bobot ekstrak Bobot bahan awal x 100; contoh perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 8
Sampel telah dihilangkan minyak atsirinya dan dalam penghitungan rendemen yang dijadikan bobot bahan awal adalah bobot bahan
ampas yang digunakan
Heksan bersifat non polar sehingga akan melarutkan senyawa-senyawa yang bersifat non polar juga. Senyawa yang umumnya terekstrak oleh heksan
adalah lilin, lemak, minyak, dan minyak atsiri. Ekstrak heksan dalam penelitian ini sudah tidak mengandung minyak atsiri karena sudah dipisahkan
terlebih dulu. Ekstrak heksan memiliki rendemen tertinggi. Tingginya
44 rendemen ekstrak heksan menunjukkan kandungan lemak biji jintan hitam
cukup tinggi. Berdasarkan hasil analisis proksimat yang dilakukan, kadar lemak biji jintan hitam adalah sebesar 31.68 .
Etanol dan etil asetat tergolong bersifat semi polar. Berdasarkan asas like dissolve like
, senyawa yang akan larut dalam etanol dan etil asetat adalah senyawa yang bersifat semi polar juga. Walaupun ekstrak etanol diperoleh
secara ekstraksi tunggal dan ekstrak etil asetat diperoleh secara ekstraksi bertingkat, rendemen ekstrak etanol 8.39 tidak berbeda jauh dengan
rendemen ekstrak etil asetat 8.60 . Senyawa yang umum larut dalam etanol adalah glikosida, sedangkan senyawa yang umum larut dalam etil asetat
adalah alkaloid, aglikon, dan glikosida. Minyak atsiri memiliki aroma yang menyengat, khas jintan hitam.
Ekstrak air dan etanol masih memberikan aroma jintan hitam karena sebelum proses ekstraksi tidak dilakukan pemisahan komponen volatil seperti
penyulingan minyak atsiri. Ekstrak heksan, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol sudah tidak memberikan aroma jintan hitam. Hal tersebut disebabkan
komponen yang memberikan aroma jintan hitam sudah terekstrak pada minyak atsiri. Menurut Belitz et. al. 1999, komponen aroma dalam rempah-
rempah umumnya terdapat dalam minyak atsiri.
D. AKTIVITAS ANTIMIKROBA
Kategori