β-karoten dan absorbansinya sehingga memperoleh suatu persamaan Y = a + bx . Kurva B dibuat dengan melarutkan standar Retinol dalam kloroform dengan konsentrasi 0,4;
0,8; 1,2 μgml. Dari masing-masing konsentrasi Retinol dibaca pada panjang gelombang
450 nm kemudian diplotkan seperti halnya kurva A. Kurva C dibuat dengan membuat seri pengenceran standar retinoldalam kloroform 0,2; 0,6 dan 1,2
μgml.
3.3.4.2 Pengukuran kadar retinol plasma
Pengukuran kada β-karoten dan retinol dalam plasma darah dilakukan dengan
metode TFA. Plasma darah sebanyak 2 ml ditambahkan dengan 2 ml etanol 95 dan ditambahkan dengan Petroleum eter sebanyak 3 ml kemudian campuran tersebut
divortex selama 2 menit dilanjutkan dengan sentrifugasi 1500 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil menggunakan pipet pasteur sebanyak 2 ml. Kemudian dibaca
absorbansinya pada panjang gelombang 450 nm menggunakan spektofotometer double beam dengan blanko petroleum eter. Absorbansi dicatat sebagai A 450 sampel.
Untuk pengukuran kadar retinol plasma maka dilanjutkan dengan menguapkan Petroleum Eter dengan mengkondisikan pada waterbath bersuhu 40°C yang merupakan
titik didih dari Petroleum Eter sampai Petroleum Eter menguap habis. Kemudian dalam sampel ditambahkan 0,1 ml kloroform dan 0,1 ml asetat anhidrat serta 1 ml pereaksi
TFA divortex dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 620nm dengan blanko 1 ml TFA+ 0,1 ml kloroform.
Absorbansi yang terbaca pada panjang gelombang 620 dinyatakan sebagai A620 sampel.
Konsentrasi β-karoten plasma dihitung dengan rumus perhitungan sebagai
berikut: β-karoten plasma mgL = A 450 dari sampel x Konsentrasi standar x 3
A 620 dari standar Retinol plasma mgL = A 620 dari sampel x Konsentrasi standar x 32
A 620 dari standar 3.3.4.3 Analisa Aktivitas Enzim AST Kit komersial AMS
Kurva standar oksaloasetat dibuat agar dapat menghitung kadar oksaloasetat yang terbentuk akibat aktivitas enzim AST pada sampel. Pada Tabel 9 disajikan seri
pengenceran yang akan dibuat kurva standar AST.
Tabel 9 seri pengenceran pada pembuatan kurva standar AST Tabung Standar
oksaloasetat Air
distilasi Buffer AST
1 0,0 0,2 1,0
2 0,05 0,2
0,95 3 0,1 0,2
0,9 4 0,15
0,2 0,85
5 0,2 0,2 0,8
6 0,25 0,2
0,75 7 0,3 0,2
0,7 8 0,35
0,2 0,65
9 0,4 0,2 0,6
10 0,45 0,2 0,55 Masing-masing tabung ditambahkan reagen pewarna AST sebanyak 1ml
kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar dan ditambhkan NaOH sebanyak 10 ml baca absorbansinya pada panjang gelombang 546nm dan tabung
pertama digunakan sebagai blanko. Sampel plasma darah sebanyak 100
μl ditambahkan ditambahkan 500μl buffer AST kemudian diinkubasi selama 30 menit pada waterbath suhu 37°C. Kemudian
ditambahkan reagen pewarna AST sebanyak 500 μl dan diinkubasi pada suhu kamar
25°C selama 20 menit lalu ditambahkan NaOH sebanyak 5 ml kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm dengan blanko 500
μl buffer AST ditambah 100
μl air distilasi diinkubasi 30 menit pada suhu 37°C dan ditambahkan 500
μl reagen pewarna AST diinkubasi suhu kamar 20 menit.
3.4.4.4 Analisa Aktivitas Enzim ALT Kit komersial AMS.
Kurva standar piruvat dibuat agar dapat menghitung kadar priruvat yang terbentuk akibat aktivitas enzim ALT pada sampel. Pada Tabel 10 disajikan seri
pengenceran yang akan dibuat.
Tabel 10 seri pengenceran pada pembuatan kurva standar ALT Tabung
Standar Piruvat
Air distilasi
Buffer ALT 1
0,0 0,2
1,0 2
0,05 0,2
0,95 3
0,1 0,2
0,9 4
0,15 0,2
0,85 5
0,2 0,2
0,8 6
0,25 0,2
0,75 7
0,3 0,2
0,7 8
0,35 0,2
0,65 9
0,4 0,2
0,6 10
0,45 0,2
0,55 Masing-masing tabung ditambahkan reagen pewarna ALT sebanyak 1ml
kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar dan ditambahkan NaOH sebanyak 10 ml baca absorbansinya pada panjang gelombang 546nm dan tabung
pertama digunakan sebagai blanko. Sampel plasma darah sebanyak 100
μl ditambahkan 500μl buffer ALT kemudian diinkubasi selama 30 menit pada waterbath suhu 37°C. Kemudian ditambahkan reagen
pewarna ALT sebanyak 500 μl dan diinkubasi pada suhu kamar 25°C selama 20 menit
lalu ditambahkan NaOH sebanyak 5 ml kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm dengan blanko 500
μl buffer ALT ditambah 100 μl air distilasi diinkubasi 30 menit pada suhu 37°C dan ditambahkan 500
μl reagen pewarna ALT diinkubasi suhu kamar 20 menit.
3.3.4.5 Analisa Aktivitas Enzim ALP Kit komersial AMS.
Prinsip dari analisa ini adalah enzim ALP pada sampel direaksikan dengan p- nitrofenilfosfat agar terbentuk p-nitrofenol dan laju pembentukan p-nitrofenol
berbanding lurus dengan aktivitas enzim alkalin fosfatase. Analisa aktivitas enzim ALP ini dilakukan dengan metode semi mikro dimana 20
μl sampel plasma darah ditambahkan 1000
μl buffer ALP dan ditambahkan 200μl reagen pewarna ALP kemudian dibaca absorbansinya pada menit ke-0, ke-1, ke-2 dan ke-3. Perubahan
absorbansi dinyatakan sebagai ∆Abs.
Konsentrasi ALP= ∆Abs x 3298
