Aktivitas Antibakteri Kapang Endofit Terhadap Bakteri Uji

Berdasarkan hasil analisis data menggunakan SPSS ANOVA satu arah One way pada uji Duncan, kapang endofit M16 F. oxysporum memiliki zona hambat terhadap bakteri S. aureus paling besar Lampiran 9. Kapang M16 F. oxysporum menghasilkan zona hambat terhadap S. aureus sebesar 11,2 mm. Kapang endofit M23 Diaporthe sp. memiliki zona hambat terbesar terhadap bakteri E. coli sebesar 6,3 mm. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa kapang endofit lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus daripada E. coli Gambar 6. Kapang endofit tanaman kina Colletotrichum sp. dan Phomopsis sp. yang diekstrak menggunakan etil asetat menghasilkan zona hambat lebih besar terhadap bakteri S. aureus daripada bakteri E. coli Mutiea, 2010; Pamungkas, 2010. Gambar 7. Grafik Zona Hambat Bakteri Hasil Ekstraksi Kloroform Kapang endofit seluruhnya positif menghambat pertumbuhan bakteri uji. Daya hambat ekstrak kapang menggunakan kloroform ditampilkan pada gambar 7. Hasil zona hambat kapang ekstrak kloroform terhadap bakteri S.aureus cukup besar dihasilkan oleh kapang M16 F. oxysporum, M25 C. oxysporum, M33 Kapang endofit sp. 1, M63 Pestalotiopsis sp.. Zona hambat ekstrak kapang terhadap bakteri E.coli cukup besar dihasilkan oleh kapang M16 F. oxysporum dan M33 Kapang endofit sp. 1 Gambar 7. Pelarut kloroform dan akuades sebagai kontrol negatif terbukti tidak menghasilkan area zona hambat terhadap bakteri uji. Hal ini karena keduanya tidak memiliki kemampuan sebagai antibakteri. Kontrol positif kuinin sulfat dan antibiotik kloramfenikol digunakan untuk membandingkan zona hambat yang dihasilkan oleh ekstrak kapang. Ekstrak kapang M16 F. oxysporum, M25 C. oxysporum, M33 Kapang endofit sp. 1, M63 Pestalotiopsis sp. menghasilkan zona hambat yang lebih besar dari kontrol kuinin sulfat terhadap bakteri S. aureus masing-masing sebesar 14,66 mm, 12,80 mm, 13,76 mm, 12,30 mm Gambar 7. Ekstrak kapang M16 F. oxysporum, M23 Diaporthe sp., M25 C. oxysporum, M33 Kapang endofit sp. 1 menghasilkan zona hambat yang lebih besar dari kontrol kuinin sulfat terhadap bakteri E. coli masing-masing sebesar 7,70 mm, 6,70 mm, 6,56 mm, 9,26 mm Gambar 7. Hal ini karena konsentrasi kuinin sulfat yang dihasilkan lebih besar dibandingkan isolat lain dan kontrol. Dugaan lain karena kapang endofit tersebut menghasilkan senyawa lain selain kuinin sulfat yang dapat berperan sebagai antibakteri. Mikroorganisme endofit dapat menghasilkan senyawa bioaktif selain senyawa yang terkandung di tanaman inangnya Pratiwi, 2008. Hasil zona hambat kapang endofit ekstrak kloroform terhadap bakteri S. aureus dan E. coli. dari analisis data menunjukkan nilai F tabel F hitung dan nilai P 0,05 Lampiran 8 dengan kesimpulan yang diperoleh adalah H ditolak dan H 1 diterima. Hal ini dapat dikatakan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan pada diameter zona hambat antar isolat ekstrak kloroform. Berdasarkan hasil analisis data mengguanakan SPSS ANOVA satu arah One way uji lanjut Duncan, kapang endofit M16 F. oxysporum memiliki zona hambat terhadap bakteri S. aureus paling besar Lampiran 8. Kapang M16 F. oxysporum menghasilkan zona hambat terhadap S. aureus sebesar 14,6 mm. Kapang endofit M33 kapang endofit sp. 1 menunjukkan zona hambat terbesar terhadap bakteri E. coli sebesar 9,2 mm Gambar 7. Hasil ini menunjukkan zona hambat yang dihasilkan ekstrak kapang endofit menggunakan kloroform ternyata lebih efektif dalam menghambat bakteri S. aureus dan E. coli dibandingkan ekstrak kapang endofit dengan etil asetat. Kapang endofit M16 F. oxysporum dan kapang endofit sp. 4 menghasilkan zona hambat 2x potensinya terhadap bakteri S. aureus dibandingkan dengan kontrol positif kuinin sulfat Gambar 7. Zona hambat terbesar dari ekstrak kloroform dan etil asetat terhadap bakteri uji dihasilkan oleh kapang M16 F. oxysporum. Hal ini karena kapang endofit F. oxysporum memiliki kemampuan untuk menghasilkan senyawa bioaktif antibakteri yang lebih tinggi dibandingkan kapang endofit lainnya. Kapang endofit Fusarium sp. dari lengkuas merah dan daun mimba dapat menghasilkan senyawa seperti fenol untuk menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dan E. coli Astuti, 2005; Kusumaningtyas et al., 2010. Zona hambat yang dihasilkan kapang endofit ekstrak kloroform rata-rata lebih besar dibandingkan ekstrak etil asetat. Hal ini karena senyawa yang ada pada kapang endofit lebih mudah larut atau ditarik oleh pelarut non polar seperti kloroform. Sebagian besar senyawa alkaloid dapat larut atau disari oleh pelarut non polar seperti kloroform Wibisana, 2010. Hasil pengujian antibakteri kontrol positif antibiotik kloramfenikol terhadap bakteri S. aureus dan E. coli menunjukkan adanya zona hambat. Antibiotik kloramfenikol memiliki kemampuan dalam menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Besar zona hambat yang dihasilkan pada penelitian ini terhadap bakteri S. aureus dan E. coli ialah sebesar 14,5 mm dan 17 mm Gambar 6 dan 7. Kerja dari antibiotik kloramfenikol ialah menghambat proses sintesis protein dengan cara menyerang subunit 30S yang berada di ribosom. Subunit tersebut berperan dalam proses sintesis protein, E. coli mensintesis semua asam amino yang dibutuhkan untuk sintesis protein yang terjadi di ribosom. Ribosom E. coli memiliki 2 jenis subunit yaitu partikel 50S dan partikel 30S yang akan mengalami penggabungan menjadi ribosom 70S untuk proses sintesis protein. Hal ini menyebabkan zona hambat yang dihasilkan oleh antibiotik kloramfenikol lebih besar terhadap bakteri E. coli daripada bakteri S.aureus Pratiwi, 2008. Ekstraksi kapang endofit menggunakan pelarut kloroform dan etil asetat menghasilkan rata-rata diameter zona hambat yang lebih besar terhadap pertumbuhan bakteri S. aureus dibandingkan bakteri E. coli. Bakteri S. aureus lebih peka terhadap metabolit yang dihasilkan kapang endofit daripada bakteri E. coli. Hal ini disebabkan adanya perbedaan struktur dinding sel bakteri. Struktur dinding sel bakteri Gram positif relatif sederhana yang terdiri atas tiga lapis yaitu selaput sitoplasmik, lapisan peptidoglikan dan lapisan luar yang disebut simpai. Sebaliknya, bakteri Gram negatif mempunyai struktur yang berlapis-lapis dan sangat kompleks Pratiwi, 2008. Hal lain karena senyawa yang dihasilkan oleh ekstrak kapang menghambat proses sintesis peptidoglikan dengan cara memutus ikatan silang peptida. Beberapa peptidoglikan pada tiap bakteri berbeda dalam hal bahwa rantai-rantai peptidanya tidak langsung terikat silang dengan sesamanya, melainkan terikat oleh jenis peptida lain membentuk jembatan penghubung. Bakteri S. aureus memiliki jembatan penghubung yang terdiri dari lima molekul glisin yang dapat menghubungkan dua peptide asam asetilmuramat AAM bersama-sama, sehingga apabila ikatan peptida diputus maka proses sintesis peptidoglikan pada bakteri S. aureus gagal terbentuk. Hal ini yang menyebabkan zona hambat kapang terhadap bakteri S. aureus lebih besar dibandingkan bakteri E. coli Pelczar dan Chan, 2006. Diameter zona hambat dari ekstrak kapang endofit M16 F. oxysporum hasil ekstraksi kloroform terhadap bakteri S. aureus ternyata melebihi zona hambat kloramfenikol yaitu sebesar 14,66 mm. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan senyawa antibakteri pada isolat M16 F. oxysporum bersifat kuat dan efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus. Diameter zona hambat kapang M16 F. oxysporum terhadap bakteri E. coli sebesar 11,2 mm. Dapat diketahui bahwa kapang endofit M16 F. oxysporum hasil ekstrak kloroform memiliki kemampuan yang sama dengan kloramfenikol dalam menghambat bakteri S. aureus, sedangkan kemampuan antibakteri kapang endofit hasil ekstrak kloroform ataupun etil terhadap bakteri E. coli lebih rendah dibandingkan dengan kloramfenikol.

4.3 Analisis Kandungan Alkaloid Kuinin Kapang Endofit dengan HPLC

Analisis kandungan alkaloid kuinin sulfat menggunakan HPLC yaitu secara kuantitatif. Hal ini untuk mengetahui secara pasti jumlah kandungan kuinin sulfat pada kapang. Proses ekstraksi alkaloid kuinin kapang endofit tanaman kina dilakukan menggunakan pelarut yang bersifat non polar yaitu kloroform. Sebagian besar alkaloid tidak dapat larut beberapa sedikit larut di air, tetapi dapat larut dalam pelarut organik seperti kloroform Wibisana, 2010. Kapang endofit yang diuji kandungan kuinin sulfatnya menggunakan HPLC hanya kapang yang diekstrak menggunakan pelarut kloroform. Tabel 3. Analisis Metabolit Sekunder Kuinin Kapang Endofit dengan HPLC Tanaman kina telah diketahui menghasilkan 30 jenis alkaloid. Alkaloid tanaman kina yang saat ini diketahui mempunyai nilai komersial ialah kuinin sulfat. Hasil skrining HPLC pada penelitian ini, dari 27 isolat kapang endofit yang diekstrak, terdapat hanya 6 isolat yang menghasilkan alkaloid kuinin sulfat. Keenam isolat kapang tersebut diisolasi dari bagian tanaman kina C. calisaya Isolat Area Kuinin ppm Tempat Isolasi Kapang endofit sp. 1 69,05 300,1 Ranting F. equiseti 96,54 249,1 Buah Leptosphaerulina sp. 62,29 26,68 Daun Neofusicoccum sp. 31,07 20,6 Ranting Pestalotiopsis sp. 39,99 14,37 Batang Leptosphaerulina sp. 2,48 0,65 Daun Wedd. yang berbeda yaitu ranting, buah, daun dan batang. Kapang endofit yang mengandung alkaloid kuinin sulfat yaitu F. equiseti, Leptosphaerulina sp., Neofusicoccum sp., Pestalotiopsis sp., kapang endofit sp. 1 dan Leptosphaerulina sp. Keenam isolat tersebut dikatakan menghasilkan alkaloid kuinin sulfat karena waktu retensi yang ada mendekati waktu retensi alkaloid kuinin sulfat standar yaitu 1,90 menit. Parameter yang digunakan untuk analisis kandungan alkaloid selain waktu retensi ialah luas area Lampiran 10. Hasil pada tabel di atas menunjukkan isolat M33 Kapang endofit sp. 1 mengandung kuinin sulfat paling banyak yaitu sebesar 300,1 ppm, sedangkan kapang endofit yang mengandung kuinin paling sedikit yaitu isolat M83 Leptosphaerulina sp. sebesar 0,65 ppm. Kapang endofit sp. 1 diisolasi dari bagian ranting tanaman kina, sedangkan kapang endofit Leptosphaerulina sp. dan diisolasi dari bagian daun tanaman kina. Kapang endofit sp. 1 yang diisolasi dari bagian ranting mengandung kuinin paling banyak karena C. calisaya Wedd. mengandung kuinin hampir 90 pada bagian kulit batang, cabang atau ranting. Bagian kulit akar mengandung kuinin sebanyak 60 dan bagian daun sebesar 1 Sukasmono, 1997. Kemampuan kapang endofit dalam memproduksi senyawa metabolit sekunder dipengaruhi oleh kondisi inangnya. Produksi metabolit sekunder pada tanaman dipengaruhi oleh kondisi lingkungan sekitar Petrini et al., 1992. Isolat kapang lainnya berdasarkan hasil HPLC tidak mengandung alkaloid kuinin. Tidak adanya senyawa kuinin ini karena kemampuan setiap kapang endofit dalam menyerap senyawa yang ada pada tanaman inangnya berbeda-beda Petrini et al., 1992. Tempat isolasi kapang endofit pada tanaman kina tidak terlalu mempengaruhi jumlah kandungan kuinin sulfat pada kapang. Kapang endofit genus Colletotrichum isolasi dari beberapa bagian tanaman kina C. calisaya Wedd. menunjukkan bahwa kapang endofit yang mengandung kuinin sulfat terbesar diisolasi dari bagian buah yaitu sebanyak 138 ppm Mutiea, 2010. Kapang endofit genus Phomopsis dari beberapa bagian tanaman kina C. calisaya Wedd. menunjukkan bahwa kapang yang diisolasi dari bagian batang mengandung kuinin sulfat terbesar yaitu 45 ppm Pamungkas, 2010.

4.4 Analisis GCMS Ekstrak Kloroform dan Etil Asetat Kapang Endofit

Analisis kandungan senyawa ekstrak kapang endofit menggunakan alat GCMS. Ekstrak kapang yang dianalisis dengan GCMS yaitu kapang M16 F. oxysporum. Hal ini karena ekstrak kapang tersebut menghasilkan zona hambat terbesar terhadap S. aureus dengan kloroform dan etil asetat, dan zona hambat terbesar terhadap E. coli dengan kloroform. Ekstrak kapang M16 tersebut setelah dianalisis dengan HPLC tidak mengandung kuinin sulfat. Oleh karena itu dilakukan analisis dengan GCMS untuk mengetahui senyawa yang berperan sebagai antibakteri. Hasil GCMS menunjukkan adanya beberapa senyawa yang terkandung dalam kapang endofit. Senyawa-senyawa tersebutlah yang berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. Ekstrak kapang yang diuji dengan GCMS ialah ekstrak M16 dengan pelarut kloroform dan etil asetat. Senyawa yang terdapat pada ekstrak kapang menggunakan kloroform adalah sebagai berikut.