memperoleh pengenceran 1:20, darah dihisap ke dalam pipet leukosit sampai batas 0,5 lalu diisi dengan larutan pengencer sampai tanda 11. Dua
sampai tiga tetes pertama larutan dibuang, kemudian satu tetes diteteskan pada kamar hitung dan dibiarkan menetap selama 3 menit. Sediaan
kemudian diperiksa dengan mikroskop perbesaran 40x. Penghitungan
dilakukan terhadap leukosit yang terdapat dalam persegi 1,2,3,4 atau kamar hitung hemocytometer.
Sel yang menempel di garis pemisah sebelah kiri dan di garis atas kotak persegi ikut dihitung, sel yang
menempel di kedua sisi kotak lain tidak ikut dihitung Anandika, 2011 ; Triana dan Nurhidayat, 2006 ; Kulisic et al., 2006. Jumlah leukosit
dihitung per mm
3
dengan rumus sebagai berikut :
Jumlah total leukosit per mm
3
=
= = 50 N
Keterangan : N = Jumlah total leukosit dari 4 kamar hitung
4.5.7 Perhitungan Persentase Monosit dan Limfosit Darah
Sampel darah segar diteteskan pada gelas objek dan dibuat preparat apus. Setelah dibiarkan mengering di udara, preparat apus kemudian
difiksasi dengan metanol selama 5 menit. Preparat kemudian diwarnai dengan pewarna giemza dengan pengenceran 1:9 selama 30 menit buffer
fosfat pH 6,8 – 7,2. Selanjutnya preparat dicuci dengan aquades dan
dibiarkan mengering. Setelah kering preparat diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x dengan dibubuhi minyak emersi pada
permukaan sediaan apus tersebut. Pertama – tama dihitung sampai 100 sel
leukosit, kemudian dari 100 sel leukosit tadi dihitung jumlah monosit dan limfosit, lalu ditentukan persentase monosit dan limfosit dari total 100
leukosit tersebut dengan rumus sebagai berikut Handajani dan Ruben, 2009 :
4.5.8 Pengukuran Titer Antibodi
a Pembuatan Larutan PBS pH 7,2
K
2
HPO
4
ditimbang sebanyak 9,35 gr, KH
2
PO
4
sebanyak 3,45 gr, dan NaCl sebanyak 4,5 gr. Semua bahan dilarutkan dalam 1000 mL
akuades, kemudian diukur pH larutan hingga mencapai 7,2 Achyat et al., 2008.
b Pembuatan Suspensi Sel Darah Merah Domba SDMD
Darah domba disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang berupa plasma dibuang dengan pipet, kemudian
ditambahkan larutan PBS pH 7,2 sebanyak tiga kali volume SDMD yang tersisa. Tabung dibolak
– balik agar tersuspensi rata, kemudian
disentrifugasi kembali dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit, lalu supernatan dibuang. Pencucian dilakukan sebanyak 3
– 4 kali hingga diperoleh larutan yang benar
– benar jernih pada supernatannya. Pada pencucian terakhir semua supernatan dibuang. SDMD yang terdapat dalam
tabung merupakan suspensi SDMD 100 Achyat et al., 2008.
c Pengumpulan Serum dari Darah Mencit
Darah mencit diambil melalui ekor dengan cara memotong ujung ekor mencit. Darah yang keluar segera dihisap menggunakan mikropipet
dan ditampung dalam tabung eppendorf kosong hingga terkumpul sebanyak minimal 0,1 mL. Darah yang terdapat dalam tabung eppendorf
didiamkan pada suhu kamar selama 1 – 2 jam, kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit, supernatan serum lalu diisolasi menggunakan alat suntik steril Sasmito et al., 2006. Serum
disimpan pada suhu -20 C sampai saat digunakan untuk perhitungan titer
antibodi dengan metode hemaglutinasi.
d Pengukuran Titer Antibodi dengan Metode Hemaglutinasi
Achyat et al., 2007 ; Vaghasiya et al., 2010
1 Melakukan dekomplementasi inaktivasi serum pada suhu 56 C
selama 30 menit untuk mencegah lisis sel darah merah domba SDMD yang dapat mengaburkan reaksi hemaglutinasi.
2 Mikroplate diberi label pada sumur – sumurnya dengan nomor 1 – 12.
3 50 µL PBS ditambahkan ke dalam sumur nomor 2 – 12, sedangkan sumur nomor satu dibiarkan kosong.
4 100 µL serum yang telah diinaktivasi ditambahkan ke dalam sumur nomor satu.
5 50 µL serum dari sumur nomor satu diambil, lalu ditambahkan ke dalam sumur nomor dua, kemudian dihomogenkan.
6 50 µL serum dari sumur nomor dua diambil, lalu ditambahkan ke ke dalam sumur nomor tiga, kemudian dihomogenkan. Begitu
seterusnya sampai sumur nomor 12 sehingga didapatkan 12 seri pengenceran dengan kelipatan dua, yaitu 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16,
1:32, 1:64, 1:128, 1: 256, 1:512, 1:1024, dan 1:2048. 7 1 SDMD sebanyak 50 µL ditambahkan ke dalam semua sumur
nomor 1 – 12, kemudian dihomogenkan, lalu disimpan pada suhu
kamar selama dua jam. 8 Nilai titer antibodi ditentukan dari pengenceran tertinggi yang
masih memperlihatkan terjadinya hemaglutinasi. Angka hasil pembacaan titer yang berupa deret ukur dikonversikan ke dalam
deret hitung dengan rumus sebagai berikut :
4.5.9 Uji Tantang
