Jenis dan Rancangan Penelitian Alat atau Instrumen Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

32

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

Variabel- variabel yang digunakan adalah sebagai berikut :

1. Variabel utama

a. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi dosis pemberian ekstrak metanol-air biji P. americana. b. Variabel tergantung Variabel tergantung penelitian ini adalah penurunan kadar serum kreatinin dan gambaran histologis ginjal akibat pemberian jangka panjang ekstrak metanol-air biji P. americana pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi hewan uji, yaitu tikus jantan galur Wistar dengan berat badan 150-250 g dan umur 2-3 bulan, frekuensi pemberian ekstrak metanol-air biji P. americana satu kali sehari selama enam hari berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama, cara pemberian senyawa pada tikus dilakukan secara per oral dan intraperitoneal, dan bahan uji yang digunakan berupa biji P. americana yang diperoleh dari Padang, Sumatera Barat diambil pada bulan Januari 2013. b. Variabel pengacau tak terkendali Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi patologis dari tikus jantan galur Wistar yang digunakan.

3. Definisi operasional

a. Ekstrak metanol-air biji P. americana. Ekstrak metanol-air biji P. americana adalah ekstrak kental yang diperoleh dengan mengekstraksi serbuk kering biji P. americana seberat 10,0 g yang dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol-air secara maserasi perendaman selama 5x24 jam , hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner, yang dilapisi kertas saring, sehingga diperoleh filtrat. Serbuk sisa perendaman diremaserasi kembali dengan metanol 70 selama 2x24 jam. Setelah remaserasi, disaring dengan kertas saring, dieva porasi dengan suhu 70˚C dan diuapkan di atas waterbath dengan suhu 80˚C, hingga diperoleh bobot ekstrak tetap. b. Dosis ekstrak metanol-air biji P. americana. Dosis ekstrak metanol-air biji P. americana adalah sejumlah gram ekstrak metanol-air biji P. americana tiap satuan kg berat badan dari subyek uji. Ekstrak biji P. americana dibuat dengan mengekstraksi sejumlah gram serbuk biji P. americana dalam pelarut polar metanol-air. c. Penurunan kadar serum kreatinin. Didefinisikan sebagai kemampuan ekstrak metanol-air biji P. americana pada dosis tertentu untuk menurunkan kadar serum kreatinin pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida. d. Pemberian jangka panjang. Pemberian ekstrak metanol-air biji P. americana satu kali selama enam hari berturut-turut.

C. Bahan Penelitian

1. Bahan utama

a. Hewan uji yang digunakan berupa tikus jantan galur Wistar dengan umur 2- 3 bulan dan berat badan 150-250 g yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Biji P. americana yang diperoleh dari Padang, Sumatera Barat yang diambil pada bulan Januari 2013.

2. Bahan kimia

a. Bahan nefrotoksin yang digunakan adalah karbon tetraklorida yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Metanol dan air suling sebagai pelarut yang digunakan untuk pembuatan sediaan uji diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. c. Aqua bidestilata untuk blanko pengujian kreatinin, yang dipeoleh dari laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. d. Kontrol serum Kreatinin Cobas® PreciControl ClinChem Multi 2 RocheHitachi analyzer e. Olive oil Bertolli® f. Reagen serum kreatinin

D. Alat atau Instrumen Penelitian

1. Alat ekstraksi Seperangkat alat gelas berupa beker gelas, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, cawan porselen, corong Buchner, pipet tetes, batang pengaduk pyrex Iwaki Glass®. Mesin penyerbuk Retsch®, ayakan no 40 Electric Sieve Shaker Indotest Multi Lab®, timbangan analitik Mettler Toledo®, moisture balance, orbital shaker Optima®, rotary vacuum evaporator IKAVAC®, oven Memmert®. 2. Alat uji nefroprotektif Seperangkat alat gelas berupa bekker glass, gelas ukur, tabung reaksi, labu ukur, pipet tetes, batang pengaduk Pyrex Iwaki Glass®. Timbangan elektrik Mettler Toledo®, sentrifuge Centurion Scientific®, vortex Genie Wilten®, spuit per oral dan syringe 3 cc Terumo®, spuit ip. dan syringe 1 cc Terumo®, pipa kapiler, tabung Eppendorf, Microlab 200 Merck®.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi serbuk biji P. americana

Determinasi biji P. americana dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri makroskopis dan mikrokopis serbuk biji P. americana yang berasal dari Padang dengan serbuk biji yang telah diketahui pasti merupakan serbuk biji P. americana Mill berdasar ciri-ciri morfologinya.

2. Pengumpulan bahan

Bahan uji yang digunakan adalah biji P. americana yang sudah dalam bentuk serbuk berwarna kuning kecoklatan, yang diperoleh dari wilayah Padang, Sumatera Barat, pada bulan Januari 2013.

3. Pembuatan serbuk

Biji P. americana dicuci bersih di bawah air mengalir dan bagian kulit ari dari biji alpukat tersebut dibuang. Setelah bersih biji dipotong kecil-kecil dan diangin-anginkan hingga biji tidak tampak basah kemudian dilakukan pengeringan menggunakan oven pada suhu 50 ˚C selama 24 jam. Setelah kering biji dibuat serbuk dan diayak dengan ayakan nomor 40 supaya kandungan fitokimia yang terkandung dalam biji P. americana lebih mudah terekstrak karena luas permukaan serbuk yang kontak dengan pelarut semakin besar.

4. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill

Penetapan kadar air serbuk biji P. americana bertujuan untuk mengetahui kadar air dalam serbuk dan untuk memenuhi persyaratan serbuk yang baik, yaitu kurang dari 10 Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995. Penetapan kadar air serbuk biji P. americana dilakukan dengan menggunakan alat moisture balance menggunakan metode susut bobot pengeringan. Serbuk dipanaskan pada suhu 105 ˚C selama 15 menit. Kemudian serbuk ditimbang ulang dan dihitung sebagai bobot sesudah pemanasan. Selisih bobot sebelum pemanasan dan sesudah pemanasan merupakan kadar air dari sampel yang diteliti.

5. Pembuatan pelarut metanol-air 70:30

Larutan metanol-air 70:30 digunakan sebagai cairan penyari pada tahap maserasi pembuatan ekstrak biji P. americana. Dasar pemilihan larutan penyari ini berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Carpena, dkk. 2011, yang menyatakan bahwa biji P. americana yang diekstraksi dengan metanol-air 70:30 dapat menyari senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan yang bersifat polar.

6. Pembuatan ekstrak metanol-air biji P. americana

Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi. Sebanyak 10 g serbuk biji P. americana direndam dalam 100 mL pelarut metanol-air 70:30 pada suhu kamar selama 5x24 jam. Tujuan dilarutkan dalam pelarut metanol agar senyawa kimia yang terkandung dalam biji P. americana dapat larut dalam pelarut. Setelah dilakukan perendaman, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner, yang dilapisi kertas saring, sehingga diperoleh filtrat. Serbuk sisa perendaman diremaserasi kembali dengan metanol 70 selama 2x24 jam. Filtrat hasil saringan dipindahkan dalam labu alas bulat untuk dievaporasi. Tujuan proses evaporasi adalah menguapkan cairan penyari pada proses maserasi. Prinsip alat vaccum evaporator adalah menguapkan pelarut dengan suhu rendah dan berputar dan menggunakan tekanan tinggi untuk membantu proses penguapan. Hasil evaporasi dituangkan dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya, agar mempermudah perhitungan rendemen ekstrak yang akan diperoleh. Cawan porselen yang berisi larutan hasil evaporasi dipanaskan di atas waterbath dengan suhu 80 ˚C untuk mendapatkan ekstrak metanol-air biji P. americana yang kental dengan bobot pengeringan ekstrak yang tetap. Menghitung rata-rata rendemen lima replikasi ekstrak metanol biji Persea americana kental yang telah dibuat. Rendemen ekstrak = berat cawan ekstrak kental – berat cawan kosong Rata-rata rendemen = = 2,78 g

7. Penetapan konsentrasi pekat ekstrak

Konsentrasi yang dapat digunakan adalah konsentrasi pekat yang dapat dibuat dimana pada konsentrasi tersebut ekstrak dapat dimasukkan serta dikeluarkan dari spuit oral. Cara pembuatannya adalah dengan melarutkan ekstrak per cawannya dengan pelarut yang sesuai, yaitu CMC Na 1 Kurniawati, dkk., 2011.

8. Penetapan dosis ekstrak metanol-air biji P. americana

Penetapan peringkat dosis didasarkan pada perhitungan dengan bobot tikus paling besar yaitu 250 gram, konsentrasi ekstrak etanol biji P.americana yang dapat dimasukkan dan dikeluarkan melalui spuit oral yaitu 7 atau 70mgml, serta volume maksimal pemberian oral yaitu 5 mL. Maka dosis tertinggi dapat ditentukan sebagai berikut : BB x D = C x V Berat badan kg x dosismgkgBB = konsentrasi mgml x volume pemberian mL 0,250 kg x D = 70mgmL x 5 mL D = 1400 mgkgBB Dosis tengah dan dosis rendah ditentukan dengan menurunkan dua kelipatan dari dosis tertinggi sehingga diperoleh dosis 700 dan 350 mgkgBB.. Dosis yang akan digunakan dalam penelitian adalah 350, 700, dan 1400 mgkgBB.

9. Pembuatan larutan karbon tetraklorida

Menurut penelitian Janakat dan Al-Merie 2002, pembuatan karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50. Larutan karbon tetraklorida ke dalam olive oil sebanyak 50 ml.

10. Pembuatan suspending agent CMC-Na 1

Suspending agent CMC-Na 1 dibuat dengan cara mendispersikan lebih kurang 1,0 g CMC-Na yang telah ditimbang seksama, digerus, dan dikembangkan, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan di add dengan aquadest sampai batas tanda. CMC-Na yang telah dibuat digunakan untuk melarutkan ekstrak metanol-air biji P. americana.

11. Uji pendahuluan

a. Penetapan dosis nefrotoksin karbon tetraklorida. Pemilihan dosis karbon tetraklorida dilakukan untuk mengetahui pada dosis berapa karbon tetraklorida mampu menyebabkan kerusakan ginjal tikus yang ditandai dengan peningkatan kadar kreatinin dalam serum darah paling tinggi. Dosis nefrotoksik yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada penelitian Moneim dan El-Deib 2012, bahwa dosis 2 mlkg terbukti mampu meningkatkan kadar kreatinin serum pada tikus bila diberikan secara intraperitonial i.p. b. Penetapan waktu pencuplikan darah. Berdasarkan hasil orientasi kenaikan kadar serum kreatinin terjadi pada waktu 48 jam dan terjadi penurunan pada waktu 72 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida. Pada penelitian ini dilakukan orientasi dengan cuplikan dari jam 0, 24, 48, dan 72 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida untuk melihat profil kenaikan kadar serum kreatinin. Untuk mendapatkan waktu pencuplikan darah dilakukan orientasi dengan satu kelompok. Dalam satu kelompok terdiri dari 5 ekor tikus. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata. Pada jam ke 0, 24, 48, dan 72 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida. Kemudian kadar serum kreatinin diukur.

12. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji

Sejumlah tiga puluh ekor tikus dibagi secara acak ke dalam enam kelompok perlakuan dengan masing-masing sejumlah lima ekor tikus. a. Kelompok I kontrol nefrotoksin diberi larutan karbon tetraklorida : olive oil 1:1 dosis 2 mlkgBB secara i.p. b. Kelompok II kontrol negatif diberi olive oil dosis 2 mlkgBB secara i.p. c. Kelompok III kontrol ekstrak diberi ekstrak metanol-air biji P. americana dosis 1,4 gkgBB secara per oral sekali sehari selama enam hari berturut-turut. d. Kelompok IV dosis tinggi diberi ekstrak metanol-air biji P. americana dosis 0,35 gkgBB secara per oral sekali sehari selama enam hari berturut- turut. e. Kelompok V dosis tengah diberi ekstrak metanol biji P. americana dosis 0,7 gkgBB secara per oral sekali sehari selama enam hari berturut-turut. f. Kelompok VI dosis rendah diberi ekstrak metanol biji P. americana dosis 1,4 gkgBB secara per oral sekali sehari selama enam hari berturut- turut. Pada hari ke tujuh kelompok IV-VI dipejani karbon tetraklorida dosis 2 mlkgBB secara intraperitoneal. Setelah 48 jam diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata, kadar serum kreatinin diukur.

13. Pembuatan serum

Darah diambil melalui bagian sinus orbitalis mata tikus lalu ditampung dalam tabung Eppendorf. Darah didiamkan selama kurang lebih 15 menit, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 10000 rpm dan bagian supernatannya diambil.

14. Penetapan aktivitas serum kontrol, serum kreatinin

Alat yang digunakan untuk menganalisis kadar kreatinin serum adalah Mikrolab 200 Merck®. Kadar enzim dinyatakan dengan satuan mgdL. Pengukuran kadar kreatinin serum dilakukan di Laboratorium Biokimia Fisiologi Manusia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. a. Penetapan kadar serum kontrol. Analisis dilakukan dengan cara mencampur 1000 μL reagen I, kemudian dicampurkan 50 μL serum kontrol, divortex selama 5 detik dan didiamkan selama dua menit. Setelah itu, ditambahkan 250 μL reagen II, divortex selama 5 detik dan resapan dibaca setelah satu menit.

b. Penetapan kadar serum kreatinin. Analisis serum kreatinin dilakukan dengan

cara mencampur 10 00 μL reagen I, kemudian dicampur dengan 50 μL serum, divortex selama 5 detik, dan didiamkan selama dua menit. Setelah itu, ditambahkan 250 μL reagen II, divortex selama 5 detik, dan resapan dibaca setelah satu menit.

15. Pembuatan larutan formalin 10

Formalin yang diperoleh memiliki konsentrasi 37. Untuk memperoleh formalin dengan konsentrasi 10 maka dilakukan pengenceran formalin dengan cara mengambil sebanyak 270 mL formalin 37, dimasukkan dalam labu takar 1L, dan ditambah aquadest hingga batas tanda. Campuran tersebut digojog hingga homogen.

16. Pencuplikan organ ginjal tikus untuk pengamatan gambaran histologis

Tiga ekor tijus jantan galur wistar diambil secara acak dari setiap kelompok perlakuan. Hewan uji yang telah diambil darahnya pada jam ke-48 dikorbankan dengan menggunakan eter. Selanjutnya dilakukan nekropsi hewan uji tikus untuk mengambil organ ginjal. Organ ginjal dicuci dengan larutan saline 0,9 untuk menghilangkan darah. Kemudian ginjal disimpan dan diawetkan dengan larutan formalin 10.

17. Pembuatan preparat histologi ginjal

Pembuatan preparat histologi ginjal dilakukan oleh Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Preparat histologi ginjal ini sebagai pembanding data kadar serum kreatinin terhadap efek nefroprotektif biji P. americana.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data kadar serum kreatinin dianalisis dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui normalitas data pada masing-masing kelompok perlakuan. Nilai normal suatu data ditunjukkan dengan nilai p0,05. Apabila hasil analisis statistik Kolmogorov-Smirnov kadar serum kreatinin menunjukkan distribusi data normal p0,05, dilanjutkan dengan analisis One Way Anova. Analisis ini digunakan untuk melihat homogenitas data. Apabila hasil tersebut menunjukkan nilai signifikansi p0,05, berarti data tersebut homogen. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk mengetahui kebermaknaan perbedaan antar kelompok. Jika diperoleh distribusi data yang tidak normal maka dilakukan analisis data menggunakan Kruskal-Wallis untuk melihat homogenitasnya, dan dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk melihat kebermaknaan perbedaan antar kelompok. Perhitungan persen efek nefrotoksin terhadap nefrotoksin ginjal, yang diperoleh dengan rumus: 45

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian dan besar dosis efektif nefroprotektif ekstrak metanol-air biji P. americana pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida dengan melihat kadar serum kreatinin dan gambaran histologis ginjal. Tujuan tersebut dapat tercapai dengan serangkaian pengujian.

A. Penyiapan Bahan

1. Hasil determinasi serbuk biji P. americana

Determinasi tanaman dilakukan dengan tujuan memastikan bahwa serbuk yang digunakan adalah benar P. americana. Serbuk yang akan digunakan adalah serbuk biji P. americana yang berasal dari Padang, Sumatera Barat, yang kemudian dibandingkan dengan serbuk biji spesies P. americana yang dideterminasi di laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Bagian tanaman yang digunakan untuk determinasi adalah biji buah P. americana yang kemudian diserbuk. Determinasi dilakukan dengan cara mencocokkan kesamaan ciri makroskopis dan mikroskopis antara serbuk biji P. americana yang diperoleh dari Padang, Sumatera Barat dan serbuk biji spesies P. americana pembanding. Hasil determinasi membuktikan bahwa benar tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah Persea americana Mill lampiran 5.