3.1.4 Analisis asam lemak AOAC 1999
Metode analisis yang digunakan memiliki prinsip mengubah asam lemak menjadi turunannya, yaitu metil ester sehingga dapat terdeteksi oleh alat
kromatografi. Analisis dengan kromatografi gas didasarkan pada partisi komponen-komponen dari suatu cairan di antara fase gerak berupa gas dan
fase diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudah menguap yang melekat pada bahan pendukung inert. Komponen-komponen yang dipisahkan harus mudah
menguap pada suhu pemisahan yang dilakukan, sehingga suhu operasi biasanya lebih tinggi dari suhu kamar dan biasanya dilakukan derivatisasi untuk contoh
yang sulit menguap. Sampel lemak atau minyak dihidrolisis menjadi asam lemak, kemudian
ditransformasi menjadi bentuk esternya yang bersifat lebih mudah menguap. Transformasi dilakukan dengan cara metilasi sehingga diperoleh metil ester asam
lemak FAME. Selanjutnya FAME dianalisis dengan alat kromatografi gas. Alat kromatografi gas yang digunakan adalah kromatografi gas Shimadzu GC 2010.
Identifikasi tiap komponen asam lemak dilakukan dengan membandingkan waktu retensinya dengan waktu retensi standar pada kondisi analisis yang sama.
Waktu retensi dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada saat muncul pelarut sampai ke tengah puncak komponen yang dipertimbangkan. Luas
puncak dari masing-masing komponen adalah berbanding lurus dengan jumlah komponen tersebut dalam contoh.
1
Tahap ekstraksi Terlebih dahulu diperoleh asam lemak dengan metode sohxlet. Pada tahap
ini akan diperoleh lemak dalam bentuk minyak. Sampel tersebut ditimbang sebanyak 20-30 mg lemak untuk dilanjutkan pada tahap metilasi.
2 Pembentukan metil ester metilasi
Tahap metilasi dimaksudkan untuk membentuk senyawa turunan dari asam lemak menjadi metil esternya. Asam-asam lemak diubah menjadi ester-ester
metil atau alkil yang lainnya sebelum disuntikkan ke dalam kromatografi gas. Metilasi dilakukan dengan merefluks lemak di atas penangas air dengan pereaksi
berturut-turut NaOH-metanol 0,5 N, BF
3
20, NaCl jenuh dan isooktan. Sebanyak 20-30 mg lemak dari sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
ditambahkan 1 ml NaOH 0,5 N dalam metanol lalu dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit pada suhu 80
o
C. Larutan kemudian didinginkan. Sebanyak 2 ml BF
3
20 dan 5 mgml standar internal ditambahkan ke dalam tabung lalu tabung dipanaskan kembali pada waterbath dengan suhu 80
o
C selama 20 menit dan didinginkan. Kemudian ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan 1 ml isooktan,
dikocok dengan baik. Lapisan isooktan bagian atas larutan dipindahkan dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,1 gram Na
2
SO
4
anhidrat, didiamkan selama 15 menit. Larutan disaring dengan mikrofilter untuk
memisahkan fase cairnya sebelum diinjeksikan ke dalam kromatografi gas. Sebanyak 1
μl sampel diinjeksikan ke dalam Gas Chromatography. Asam lemak yang ada dalam metil ester akan diidentifikasi oleh Flame Ionization Detector
FID atau detektor ionisasi nyala dan respon yang ada akan tercatat melalui kromatogram peak.
3 Identifikasi asam lemak
Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksikan metil ester pada alat kromatografi gas Shimadzu GC 2010. Gas yang digunakan sebagai fase gerak
adalah gas nitrogen dengan aliran bertekanan 30 mlmenit dan oksigen dengan aliran 200-250 mlmenit. Kolom yang digunakan adalah kolom kapiler capilary
column yang panjangnya 60 m dan diameter dalam 0,25 mm dengan tebal lapisan
film 0,25 µm. Temperatur terprogram yang digunakan adalah suhu 190
o
C yang dipertahankan selama 15 menit. Kemudian suhu dinaikkan
hingga suhu akhir 230
o
C yang dipertahankan selama 20 menit, suhu injektor sebesar 220
o
C dan suhu detektor sebesar 240
o
C. Kromatografi gas Shimadzu GC 2010 yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7 Kromatografi gas Shimadzu GC 2010
Kandungan asam lemak dalam sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
Asam lemak = luas area sampel x C standar x volume sampel x 100
luas area
standar gram sampel
3.1.5 Analisis kolesterol dengan spektrofotometer Liebermann-Buchard