D. Slug Irritation Test
1. Pengumpulan dan determinasi siput
Siput diperoleh dari wilayah Perumda, Ungaran, Kabupaten Semarang. Populasi siput paling banyak ditemukan ketika musim hujan. Siput ditempatkan di
wadah plastik berlubang dan diberi makan sayuran. Determinasi dilakukan dengan mencocokan karakteristik siput dengan literatur. Determinasi siput dilakukan
untuk menentukan spesies siput yang digunakan. Perlu dilakukan determinasi karena perbedaan spesies siput dapat menyebabkan perbedaan data yang
didapatkan. Untuk klasifikasi spesies siput, dilakukan pembedahan untuk mengetahui bentuk alat kelamin siput sebagai pembeda yang khas berdasarkan
literatur. Hasil determinasi Lampiran 8 menyatakan bahwa siput yang digunakan
merupakan jenis Laevicaulis alte. 2.
Slug Irritation Test
Pada Slug Irritation Test, siput yang sudah ditimbang kemudian diletakkan di cawan petri yang sudah dibersihkan dan ditimbang sebelumnya.
Siput diberi perlakuan dengan diberi bahan-bahan uji yaitu amilum, magnesium stearat, Sodium Lauryl Sulfate, asam salisilat, sediaan bedak tabur dan arbutin
selama 60 menit. Selama 60 menit perlakuan, siput akan memproduksi mukus sebagai mekanisme pertahanan diri. Semakin iritatif suatu bahan seharusnya
produksi mukus akan semakin banyak karena produksi mukus pada siput merupakan mekanisme pertahanan diri untuk melindungi seluruh bagian tubuh
siput dari bahan iritan. Oleh karena itu produksi mukus dapat digunakan untuk melihat adanya potensi iritasi suatu bahan.
Setelah 60 menit perlakuan, siput dibersihkan dari sisa sediaan menggunakan cotton bud kemudian dipindahkan ke cawan petri baru. Siput diberi
Phospate Buffer Saline PBS pH 7,4 dan dibiarkan selama 60 menit. PBS
berfungsi untuk menarik biomarker dari siput sebagai respon kerusakan jaringan. Sampel PBS kemudian diuji menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Didapatkan
nilai absorbansi masing-masing sampel untuk 3 jenis variabel yaitu ALP, LDH dan albumin data dapat dilihat pada Lampiran 4. Nilai absorbansi kemudian
dikonversi menjadi kadar masing-masing variabel.
Tabel IX. Data slug irritation test
Bahan Uji Replikasi
Persen mukus LDH
UL ALP
UL Albumin
gdL
A m
il um
m ani
ho t
1 4,412
-3,360 11,000
-0,208 2
5,561 0,000
12,100 0,127
3 2,927
-3,360 9,900
0,509 4
4,276 3,360
5,500 0,106
5 1,379
0,000 15,400
0,172 6
3,148 10,080
3,300 0,172
7 8,477
-3,360 4,400
0,220 8
9,845 0,000
5,500 0,110
9 3,598
-3,360 19,800
0,157 10
0,006 13,440
12,100 -0,110
Ma gne
si um
s te
ar at
1 1,054
0,000 9,900
0,081 2
0,525 0,000
4,400 0,173
3 0,147
1,100 11,000
0,451 4
0,868 0,000
12,100 0,053
5 -4,481
1,100 14,300
0,172 6
1,206 0,000
9,900 0,172
7 0,427
-1,100 11,000
0,094 8
1,461 -1,100
2,200 0,157
9 1,100
0,000 13,200
0,110 10
0,906 -2,200
11,000 -0,055
Tabel IX. Data slug irritation test lanjutan
Bahan Uji Replikasi
Persen mukus LDH
UL ALP
UL Albumin
gdL
Sodi um
L aury
l S
ul fat
e 1
3,837 -3,360
33,000 0,081
2 4,500
-16,800 18,700
0,520 3
5,519 -6,720
5,500 0,497
4 4,602
6,720 29,700
0,145 5
3,447 -3,360
16,500 0,185
6 3,660
0,000 24,200
0,185 7
6,278 -3,360
27,500 0,173
8 10,277
3,360 2,200
0,157 9
27,397 -6,720
8,800 0,157
10 6,791
-3,360 23,100
-0,152 10
2,168 -3,360
9,900 -0,028
S edi
aa n
1 4,535
0,000 8,800
0,092 2
9,040 -3,360
9,900 0,520
3 10,799
3,360 13,200
0,509 4
8,209 13,440
8,800 0,198
5 10,814
0,000 11,000
0,145 6
6,146 16,800
7,700 0,172
7 10,031
0,000 6,600
0,173 8
10,632 -3,360
4,400 0,110
9 8,445
0,000 7,700
0,235 10
4,922 0,000
6,600 0,014
A rbut
in 1
0,955 0,000
7,700 0,092
2 1,496
3,360 24,200
0,497 3
0,170 3,360
16,500 0,509
4 1,861
3,360 9,900
0,158 5
2,048 3,360
7,700 0,185
6 1,002
6,720 6,600
0,172 7
1,370 10,080
9,900 0,110
8 1,712
-23,520 13,200
0,157 9
3,045 0,000
7,700 0,173
10 3,350
0,000 4,400
0,083
Parameter persen mukus dihitung dari produksi mukus yang dihasilkan dibagi dengan bobot siput kemudian dikalikan 100. Prinsip pengukuran ALP
pada penelitian ini adalah mengukur kecepatan pembentukan p-nitrofenol dari
reaksi antara reagen dan sampel uji. Jumlah p-nitrofenol yang terukur secara fotometrik sebanding dengan jumlah ALP pada sampel. Jika pada sampel terdapat
enzim ALP, maka enzim tersebut akan mengubah p-nitrofenilfosfat terdapat pada reagen menjadi p-nitrofenol. Reaksi ditunjukkan pada reaksi 1.
P-nitrofenilfosfat + H
2
O Fosfat + P-nitrofenol 1
Parameter ALP dihitung dari selisih absorbansi permenit dikalikan dengan faktor koresponding yang tertera pada petunjuk kerja reagen ALP yaitu sebesar 3.300.
Prinsip pengukuran LDH adalah dengan mengubah piruvat dan NADH pada reagen yang digunakan menjadi laktat dan NAD
+
yang akan dibaca pada panjang gelombang 340 nm. Reaksi ditunjukkan pada reaksi 2.
Piruvat + NADH Laktat + NAD
+
2 Parameter LDH dihitung dari selisih absorbansi permenit dikalikan dengan faktor
koresponding yang tertera pada petunjuk kerja reagen LDH yaitu sebesar 10.080. Prinsip pengukuran albumin adalah membuat kompleks Bromocresol
Green dengan albumin yang akan dibaca pada panjang gelombang 630 nm.
Reaksi dapat dilihat pada reaksi 3. Bromocresol green
BCG + albumin Kompleks BCG-albumin 3
Parameter albumin dihitung dari absorbansi sampel dibagi dengan absorbansi standar kemudian dikalikan dengan konsentrasi standar yang digunakan yaitu 4
gdL. Data slug irritation test Tabel IX akan digunakan untuk validasi menggunakan metode Classification and Regression Tree CART.
ALP
LDH
3. Validasi menggunakan metode Classification and Regression Tree CART
Kategori