Eksplan yang telah ditanam di dalam botol kultur diletakkan pada rak pemeliharaan dengan kondisi ruangan yang steril, suhu berkisar 17
o
C. Intensitas cahaya yang digunakan dengan penyinaran lampu neon 500 lux. Botol-botol yang berisi eksplan
diatur posisinya sehingga memudahkan untuk pengamatan. Tiap kali pengamatan hendaknya tangan dan area tempat botol yang telah berisi eksplan disterilkan dengan
alkohol 70 untuk mengurangi terjadinya kontaminasi.
3.4.6 Preparasi Reagen Protein
Coomassie Brilliant Blue G-250 sebanyak 100 mg dilarutkan kedalam 50 ml etanol 95. Larutan ini kemudian dicampur dengan 100 ml asam fosfat 85, dilarutkan
dengan 1 L akuades. Reagen kemudian disaring dengan kertas penyaring sebelum disimpan pada suhu kamar.
3.4.7 Pembuatan Kurva Standar BSA Bovine Serume Albumin
Larutan protein standar dibuat dengan melarutkan 1 g BSA dalam 100 ml akuades dan dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi. Dalam larutan ditambahkan
reagen protein Coomassie Brilliant Blue G-250 hingga volume maksimal dan dihomogenkan. Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm serta
ditentukan persamaan kurva standar larutan protein.
3.4.8 Ekstraksi Kalus
Kalus dari biji Terung Belanda yang diperoleh secara in vitro pada tiap perlakuan, ditimbang berat basahnya seberat 200 mg dalam 2X pengambilan duplo, digerus
dengan menggunakan nitrogen cair hingga terbentuk larutan. Ekstrak kemudian di homogenasikan dengan 2 ml buffer Tris-HCl 0,05 M, pH 8. Lalu larutan tersebut
disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 20 menit pada suhu 0 C hingga
Universitas Sumatera Utara
terbentuk 2 bagian yaitu bagian pertama adalah bagian supernatan yang berupa protein kalus dan bagian yang lainnya residu berupa endapan, bagian yang membentuk
supernatan berupa ekstrak kasar protein kalus diambil untuk analisis selanjutnya.
3.4.9 Analisis Protein
Prosedur analisis protein dilakukan berdasarkan metode Bradford 1976 dengan menggunakan 0,1 ml ekstrak kalus dan dicampurkan dengan 5 ml Coomassie
Brilliant Blue G-250, kemudian homogenkan. Larutan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Cara penentuan konsentrasi
protein kalus adalah dengan mengekstrapolasikan nilai absorbansi ekstrak kalus dengan kurva standard BSA Lampiran M, Halaman 53.
3.4.10 Penentuan Aktivitas Enzim
Penentuan aktivitas peroksidase dan polifenol oksidase dengan menggunakan metode Kar dan Mishra 1976. Prosedur ini berdasarkan pada kemampuan peroksidase dan
polifenol oksidase dapat mengoksidasi pyrogallol. Proses oksidasi dari enzim peroksidase dalam mengkatalisis reaksi menggunakan H
2
O
2
Kar Mishra, 1976; Maehly Chance, 1954, berbeda dengan oksidasi dari polifenol oksidase yang tidak
menggunakan H
2
O
2
. Nilai absorban kalus dikonversikan menjadi aktivitas enzim dengan menentukan pyrogallol substrat yang diubah menjadi purpurogalin.
Penentuan pyrogallol yang bereaksi adalah dengan mengekstrapolasikan nilai absorban dengan kurva pyrogallol Lampiran N, Halaman 54
3.4.10.1 Peroksidase
Pengujian aktivitas enzim ini menggunakan 5 ml pyrogallol 10 mM yang dicampurkan dengan 0,1 mM buffer posfat pada pH 6,8. Campuran ditambahkan 30
µg ekstrak kalus, dan ditambahkan 0,1 ml H
2
O
2
10 mM, di diamkan selama 5 menit
Universitas Sumatera Utara
pada suhu 25
o
C, kemudian campuran ekstrak kalus dengan pyrogallol ditambahkan 0,5 ml H
2
SO
4
5 untuk menghentikan reaksi. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm.
3.4.10.2 Polifenol Oksidase
Pengujian aktivitas enzim ini menggunakan 5 ml pyrogallol 10 mM yang dicampurkan dengan 0,1 mM buffer posfat pada pH 6,8. Campuran ditambahkan 70
µg ekstrak kalus, kemudian campuran ekstrak kalus dan pyrogallol ditambah 0,5 ml H
2
SO
4
5 untuk menghentikan reaksi. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm.
3.4.11 Parameter Pengamatan
Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah: Pengamatan secara kuantitatif
a. Berat basah kalus tanaman Terung Belanda gram
b. Persentase kontaminasi keseluruhan
persentase kultur terkontaminasi dihitung setiap hari sejak awal hingga akhir penelitian
Jumlah eksplan yang terkontaminasi persentase terkontaminasi =
X 100 Jumlah eksplan seluruh perlakuan
c. Warna Kalus
d. Persentase Kultur Yang Hidup
Jumlah eksplan yang terkontaminasi persentase terkontaminasi =
X 100 Jumlah eksplan seluruh perlakuan
e. Penentuan kadar protein
Universitas Sumatera Utara
f. Penentuan aktivitas peroksidase PO
g. Penentuan aktivitas polifenol oksidase PPO
3.5 Analisis Data
Data penelitian menggunakan metode RAL ini akan dianalisis dengan Análisis of Variace ANOVA. Sedangkan untuk menguji beda antara perlakuan dilakukan
dengan Uji Jarak Duncan UJD atau sering disebut Duncan New Multiple Range Test DNMRT Sastrosupadi, 2004.
Universitas Sumatera Utara
