BAB 3
BAHAN DAN METODA
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan Juni 2009. Tahap pengkulturan kalus dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara, Medan, Sumatera Utara. Sedangkan tahap analisis protein sampai penentuan aktivitas
peroksidase dan polifenol oksidase dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian Kelapa Sawit Marihat, Pematang Siantar, Sumatera Utara dan
Laboratorium Kimia Kuantitatif Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan Sumatera Utara.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
Adapun alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, spektrofotometer, mikrosentrifus, mikropipet, tabung reaksi, laminar air flow LAF,
botol kultur, aluminium foil, pipet serologi, alat diseksi, gelas beaker, gelas ukur, neraca analitik, erlenmeyer, cawan petri, dan kertas saring. Sedangkan bahan
penelitian yang digunakan adalah biji Terung Belanda. Buah yang digunakan berupa buah yang masih muda dengan warna kulit buah hijau kemerahan, larutan pemutih
NaOCl 5,25, fungisida, alkohol 70, akuades, agar-agar, gula, hara makro dan hara mikro.
3.3 Metoda Penelitian
Universitas Sumatera Utara
Penelitian ini menggunakan metode percobaan dengan Rancangan Acak Lengkap faktorial dengan 2 faktor, yaitu:
A. Faktor konsentrasi EMS C
C : Konsentrasi 0
C
1
: Konsentrasi 0,05 C
2
: Konsentrasi 0,10 C
3
: Konsentrasi 0,15
B. Faktor lamanya waktu perendaman T
T
1
: Selama 30 menit T
2
: Selama 60 menit T
1
: Selama 90 menit
Sehingga diperoleh 12 kombinasi, yaitu: C
T
1
C
1
T
1
C
2
T
1
C
3
T
1
C T
2
C
1
T
2
C
2
T
2
C
3
T
2
C T
3
C
1
T
3
C
2
T
3
C
3
T
3
Dibuat 1 set perlakuan dengan 6x Ulangan
3.4 Prosedur kerja
3.4.1 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini seperti cawan petri yang telah diisi kertas saring, botol kultur, erlenmeyer, pipet volume dicuci dengan deterjen dan
dibilas dengan air mengalir, dikeringkan dan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
C dengan tekanan 15 Psi selama 60 menit. Bersamaan dengan alat dimasukkan juga botol berisi akuades yang ikut dalam sterilisasi alat.
3.4.2 Pembuatan Media
Universitas Sumatera Utara
Media yang digunakan untuk penumbuhan kalus adalah media dasar MS Murashige Skoog dengan penambahan 2,4-D 1 mgl serta BAP 0,5 mgl. Komposisi media MS
dapat dilihat pada Lampiran O Halaman 55. Tahap awal pembuatan media adalah pembuatan larutan stok yang terdiri dari stok hara makro, mikro, iron, dan vitamin.
Sementara unsur lain seperti gula sukrosa dan agar dapat ditimbang langsung sesuai kebutuhan tanpa harus dijadikan larutan stok. Pembuatan media sebanyak 1000 ml.
Larutan MS dibuat dengan cara memasukkan hara makro, mikro, iron, vitamin, dan sukrosa ke dalam erlenmeyer yang ditambah akuades hingga 500 ml kemudian
dimasukkan ke dalam gelas ukur 1000 ml dan dipenuhkan dengan akuades hingga 62,5 ml. Selanjutnya larutan dibagi ke 12 perlakuan yang setiap perlakuannya berisi
200 ml. Derajat keasaman pH larutan diukur setiap perlakuan dengan menggunakan pH meter sebesar 5,8. Untuk mendapatkan pH yang optimal maka ditambahkan NaOH
0,1 N atau HCl 0,1 N.
Masing-masing media dari tiap perlakuan dimasak dengan menambahkan agar yang telah ditimbang sebanyak 0,89 gram. Kemudian dituang ke dalam botol-botol
kultur yang ditutup dengan aluminium foil steril dan diikat dengan karet gelang selanjutnya disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121
C dan tekanan 15 Psi selama 15 menit. Botol yang berisi media yang telah disterilkan kemudian disimpan dalam
ruang kultur sebelum digunakan.
3.4.3 Sterilisasi dan Perlakuan Biji Pada EMS
Eksplan yang digunakan berupa biji Terung Belanda. Biji dibersihkan dibawah air kran yang mengalir, dibilas dengan akuades steril. Biji direndam dalam agrept 1
yang ditambahkan tween 20 sebanyak 2 tetes dan dishaker selama 30 menit. Biji disterilkan dengan larutan pemutih 10 selama 5 menit, dibilas 3 kali dengan akuades
steril dan selanjutnya dengan larutan pemutih 5 selama 5 menit. Biji dicuci dengan akuades steril. Biji diletakkan di dalam cawan petri dan dikeringkan dengan kertas
saring steril. Setelah biji steril kemudian diberi perlakuan EMS dimana konsentrasinya
Universitas Sumatera Utara
meliputi 0; 0,05; 0,10 dan 0,15 dengan lama waktu perendaman selama 30, 60 dan 90 menit. Perendaman dilakukan didalam Laminar air flow LAF.
3.4.4 Penanaman Biji Pada Media MS
Sebelum melakukan penanaman diupayakan agar ruangan dalam keadaan bersih. Penanaman dilakukan di dalam laminar air flow. Alat-alat diseksi, lampu bunsen, dan
alkohol 70 dipersiapkan terlebih dahulu. Botol-botol berisi media yang sudah disterilkan, dibuka tutupnya dengan menggunakan pinset yang sudah dicelupkan pada
alkohol dan telah dibakar. Lampu bunsen digunakan untuk mencegah kontaminasi saat penanaman eksplan. Setelah tutup botol dibuka, bagian sekitar mulut botol
dilewatkan di atas api bunsen untuk memperkecil kontaminasi. Eksplan yang telah disterilkan, diambil dari dalam cawan petri dan dimasukkan ke dalam botol kultur
dengan menggunakan pinset steril. Lalu botol kultur ditutup dengan aluminium foil dan disusun di rak kultur.
Gambar 3.4.4 Penanaman biji pada media MS
3.4.5 Pemeliharaan Kultur Kalus Pada Media MS
Universitas Sumatera Utara
Eksplan yang telah ditanam di dalam botol kultur diletakkan pada rak pemeliharaan dengan kondisi ruangan yang steril, suhu berkisar 17
o
C. Intensitas cahaya yang digunakan dengan penyinaran lampu neon 500 lux. Botol-botol yang berisi eksplan
diatur posisinya sehingga memudahkan untuk pengamatan. Tiap kali pengamatan hendaknya tangan dan area tempat botol yang telah berisi eksplan disterilkan dengan
alkohol 70 untuk mengurangi terjadinya kontaminasi.
3.4.6 Preparasi Reagen Protein
Coomassie Brilliant Blue G-250 sebanyak 100 mg dilarutkan kedalam 50 ml etanol 95. Larutan ini kemudian dicampur dengan 100 ml asam fosfat 85, dilarutkan
dengan 1 L akuades. Reagen kemudian disaring dengan kertas penyaring sebelum disimpan pada suhu kamar.
3.4.7 Pembuatan Kurva Standar BSA Bovine Serume Albumin
Larutan protein standar dibuat dengan melarutkan 1 g BSA dalam 100 ml akuades dan dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi. Dalam larutan ditambahkan
reagen protein Coomassie Brilliant Blue G-250 hingga volume maksimal dan dihomogenkan. Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm serta
ditentukan persamaan kurva standar larutan protein.
3.4.8 Ekstraksi Kalus
Kalus dari biji Terung Belanda yang diperoleh secara in vitro pada tiap perlakuan, ditimbang berat basahnya seberat 200 mg dalam 2X pengambilan duplo, digerus
dengan menggunakan nitrogen cair hingga terbentuk larutan. Ekstrak kemudian di homogenasikan dengan 2 ml buffer Tris-HCl 0,05 M, pH 8. Lalu larutan tersebut
disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 20 menit pada suhu 0 C hingga
Universitas Sumatera Utara
terbentuk 2 bagian yaitu bagian pertama adalah bagian supernatan yang berupa protein kalus dan bagian yang lainnya residu berupa endapan, bagian yang membentuk
supernatan berupa ekstrak kasar protein kalus diambil untuk analisis selanjutnya.
3.4.9 Analisis Protein
Prosedur analisis protein dilakukan berdasarkan metode Bradford 1976 dengan menggunakan 0,1 ml ekstrak kalus dan dicampurkan dengan 5 ml Coomassie
Brilliant Blue G-250, kemudian homogenkan. Larutan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Cara penentuan konsentrasi
protein kalus adalah dengan mengekstrapolasikan nilai absorbansi ekstrak kalus dengan kurva standard BSA Lampiran M, Halaman 53.
3.4.10 Penentuan Aktivitas Enzim
Penentuan aktivitas peroksidase dan polifenol oksidase dengan menggunakan metode Kar dan Mishra 1976. Prosedur ini berdasarkan pada kemampuan peroksidase dan
polifenol oksidase dapat mengoksidasi pyrogallol. Proses oksidasi dari enzim peroksidase dalam mengkatalisis reaksi menggunakan H
2
O
2
Kar Mishra, 1976; Maehly Chance, 1954, berbeda dengan oksidasi dari polifenol oksidase yang tidak
menggunakan H
2
O
2
. Nilai absorban kalus dikonversikan menjadi aktivitas enzim dengan menentukan pyrogallol substrat yang diubah menjadi purpurogalin.
Penentuan pyrogallol yang bereaksi adalah dengan mengekstrapolasikan nilai absorban dengan kurva pyrogallol Lampiran N, Halaman 54
3.4.10.1 Peroksidase
Pengujian aktivitas enzim ini menggunakan 5 ml pyrogallol 10 mM yang dicampurkan dengan 0,1 mM buffer posfat pada pH 6,8. Campuran ditambahkan 30
µg ekstrak kalus, dan ditambahkan 0,1 ml H
2
O
2
10 mM, di diamkan selama 5 menit
Universitas Sumatera Utara
pada suhu 25
o
C, kemudian campuran ekstrak kalus dengan pyrogallol ditambahkan 0,5 ml H
2
SO
4
5 untuk menghentikan reaksi. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm.
3.4.10.2 Polifenol Oksidase
Pengujian aktivitas enzim ini menggunakan 5 ml pyrogallol 10 mM yang dicampurkan dengan 0,1 mM buffer posfat pada pH 6,8. Campuran ditambahkan 70
µg ekstrak kalus, kemudian campuran ekstrak kalus dan pyrogallol ditambah 0,5 ml H
2
SO
4
5 untuk menghentikan reaksi. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm.
3.4.11 Parameter Pengamatan
Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah: Pengamatan secara kuantitatif
a. Berat basah kalus tanaman Terung Belanda gram
b. Persentase kontaminasi keseluruhan
persentase kultur terkontaminasi dihitung setiap hari sejak awal hingga akhir penelitian
Jumlah eksplan yang terkontaminasi persentase terkontaminasi =
X 100 Jumlah eksplan seluruh perlakuan
c. Warna Kalus
d. Persentase Kultur Yang Hidup
Jumlah eksplan yang terkontaminasi persentase terkontaminasi =
X 100 Jumlah eksplan seluruh perlakuan
e. Penentuan kadar protein
Universitas Sumatera Utara
f. Penentuan aktivitas peroksidase PO
g. Penentuan aktivitas polifenol oksidase PPO
3.5 Analisis Data
Data penelitian menggunakan metode RAL ini akan dianalisis dengan Análisis of Variace ANOVA. Sedangkan untuk menguji beda antara perlakuan dilakukan
dengan Uji Jarak Duncan UJD atau sering disebut Duncan New Multiple Range Test DNMRT Sastrosupadi, 2004.
Universitas Sumatera Utara
0,60 0,80
1,00 1,20
t b a
sa h
k a
lu s
g
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Berat Basah kultur g
Kategori