Aktivitas Antioksidan Metode DPPH Kubo et al. 2002 dan Molyneaux Aktivitas Antidiabetes Metode inhibisi

44 yang digunakan pada penilitian ini ada dua jenis sehingga formula yang harus diujikan secara hedonik menjadi 28 formula. Dua puluh delapan formula tersebut kemudian diujikan secara organoleptik dengan metode hedonik. Tiga formula terpilih berdasarkan perlakuan ekstrak jeruk yang berbeda flavor enhancer selanjutnya dipilih untuk diberikan perlakuan berikutnya. Perlakuan yang diberikan pada minuman dikelompokkan menjadi dua, yaitu: minuman yang menggunakan kombinasi gula, pengawet natrium benzoat atau kalium sorbat atau non-pengawet dan minuman yang menggunakan kombinasi pemanis pemanis 1 atau pemanis 2, pengawet natrium benzoat atau non-pengawet. Pemilihan formula terpilih dari masing-masing perlakuan dilakukan dengan menggunakan syarat memiliki skala hedonik ≥ 6.60 dari skala 9.00. Penyeleksian tersebut menghasilkan 6 formula minuman yang kemudian dilakukan pengukuran terhadap aktivitas antioksidan metode DPPH, aktivitas antidiabetes metode inhibisi α -amilase, dan nilai pH. Penentuan perlakuan terbaik dari 6 formula minuman tersebut dilakukan dengan metode perbandngan eksponensial MPE. 3.2.3. Analisis 3.2.3.1. Nilai pH AOAC 1995 pH meter harus dikalibrasi terlebih dahulu dengan larutan buffer pH 4.0 dan pH 7.0 sebelum digunakan. Sampel sebanyak 30-50 ml diukur nilai pH-nya dengan menggunakan pH meter.

3.2.3.2. Aktivitas Antioksidan Metode DPPH Kubo et al. 2002 dan Molyneaux

2003 Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode radikal bebas DPPH 1,1-diphenyl- 2-picryl-hydrazil radical-scavenging. Ekstrak kumis kucing dan 6 formula minuman terpilih dari masing-masing perlakuan digunakan sebagai sampel pengujian aktivitas antioksidan. Asam askorbat digunakan sebagai standar pembanding terhadap aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh formula minuman. Oleh karena itu, aktivitas antioksidan minuman akan dihitung berdasarkan kesetaraannya dengan aktivitas antioksidan dalam ppm AEAC Ascorbic acid Equivalent Antioxidant Capacity. Metode pengukuran aktivitas antioksidan secara spesifik dapat dilihat pada Gambar 2. Pencampuran 2 ml larutan buffer asetat pH 5.5, 3.75 ml metanol, dan 200 l larutan DPPH 3 mM dalam metanol Pemvorteksan larutan campuran Penambahan 50 l larutan sampel atau larutan standar antioksidan Pengiinkubasian pada suhu 37°C selama 30 menit Pembacaan absorbansi sampel dengan spektrofotometer pada λ = 517 nm Gambar 2. Pengukuran aktivitas antioksidan metode DPPH Kubo et al. 2002; Molyneaux 2004 45

3.2.3.3. Aktivitas Antidiabetes Metode inhibisi

αααα -amilase Thalapaneni et al. 2008 Larutan enzim α-amilase dibuat dengan melarutkan 50 mg enzim α-amilase 54 IUmg dari Bacillus subtilis dalam 50 ml buffer fosfat A. Buffer fosfat A diperoleh dengan melarutkan 600 mg NaH 2 PO 4 , 292.5 mg NaCl, 4.7 mg CaCl 2 dan 100 mg bovine serum albumin dalam 100 ml air suling dan ditambahkan NaOH 1 M hingga pH mencapai 6.9. Larutan substrat diperoleh dengan melarutkan 1 g pati dalam 100 ml buffer fosfat B pada suhu dibawah 90 C selama 15 menit. Buffer fosfat B dibuat dengan melarutkan 240 mg NaH 2 PO 4 dan 39.2 mg NaCl dalam 100 ml air suling dan NaOH 1 M ditambahkan sedikit demi sedikit hingga pH 6.9. Reagen warna dibuat dengan mecampurkan 20 ml larutan Na-K-tartarat, 50 ml larutan DNS, dan air suling hingga diperoleh volume akhir 100 ml. Larutan Na-K-tartarat dibuat dengan melarutkan 30 g Na-K-tartarat dalam 20 ml NaOH 2 M di atas hot plate tidak sampai mendidih. Larutan DNS diperoleh dengan melarutkan 1094.88 mg asam 3.5- dinitrosalisilat dalam 50 ml air suling pada suhu 45-50 C. Sampel pada analisis ini berupa : 1 minuman formula sebelumnya Kordial 2009, 2 enam formula minuman terpilih dari masing- masing perlakuan. Kedua sampel dianalisis dalam satu perlakuan jumlah sampel yang ditambahkan yaitu 1 kali jumlah ekstrak dalam 100 ml minuman fungsional berbasis kumis kucing. Campuran reaksi diperoleh dengan melarutkan 250 µl larutan sampel dan 250 µl larutan enzim. Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 25 C selama 10 menit, setelah itu larutan pati ditambahkan sebanyak 250 µl dan diinkubasi kembali pada suhu 25 C selama 10 menit. Reagen warna selanjutnya ditambahkan sebanyak 500 µl dan diinkubasi kembali selama 5 menit pada air mendidih. Air suling sebanyak 5000 µl selanjutnya ditambahkan dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Tabel 4. Jumlah larutan pada analisis inhibisi α-amilase Larutan Blanko Kontrol + Kontrol - Sampel Sampel - - 250 µl 250 µl Buffer B 500 µl 250 µl 250 µl - Enzim - 250 µl - 250 µl Pati 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl Reagen warna 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl Air suling 5000 µl 5000 µl 5000 µl 5000 µl Perhitungan persentase inhibisi dapat dihitung dengan persamaan 3.1. inhibisi = {A1-A2 A1} x 100 3.1 Keterangan: A1 = Absorbansi kontrol + – Absorbansi blanko A2 = Absorbansi sampel – Absorbansi kontrol -

3.2.3.4. Uji Hedonik