10. Desain faktorial merupakan aplikasi persamaan regresi untuk memberikan
model hubungan antara variabel respon dengan satu atau lebih variabel bebas. 11.
Contour plot merupakan grafik hasil respon sifat fisis dan stabilitas fisik krim ekstrak daun jambu biji.
12. Superimposed contour plot merupakan grafik pertemuan yang memuat semua
arsiran dalam contour plot yang diprediksi sebagai area optimum. 13.
Area optimum merupakan area dalam superimpossed contour plot yang menghasilkan krim dengan daya sebar 5-7 cm dan viskositas 100-150 d.Pa.s.
14. Potensi antibakteri krim merupakan kemampuan krim ekstrak daun jambu biji
untuk menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus, dilihat dari luas zona hambat yang dihasilkan dan dibandingkan dengan kontrol basis krim
15. Luas zona hambat merupakan parameter uji potensi antibakteri dengan cara
mengukur luas zona jernih yang dihasilkan.
D. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk daun jambu biji yang diperoleh dari Merapi Farma Herbal, Tween 80 kualitas
farmasetis, metil paraben kualitas farmasetis, Butylated hydroxytoluene kualitas farmasetis, trietanolamin kualitas farmasetis, asam stearat kualitas
farmasetis, sorbitol kualitas farmasetis, etanol 70 teknis, aquadest, media pertumbuhan bakteri Mueller Hinton agar dan strain bakteri Staphylococcus
aureus .
E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu glasswares PYREX- GERMANY, pipet tetes, mikroskop merk Olympus CH2-Japan, kertas pH
universal, cawan petri, labu erlenmeyer, maserator, shaker, vacuum rotary evaporator,
mixer modifikasi USD, waterbath, stopwatch, timbangan analitik Mettler Toledo GB 3002, alat uji daya sebar modifikasi USD dan viscotester
seri VT 04 Rion™-Japan.
F. Tata Cara Penelitian
1. Ekstraksi daun jambu biji
Sebanyak 500 gram serbuk daun jambu biji ditimbang, kemudian dimasukan ke dalam erlenmeyer. Maserasi dilakukan selama 3 hari menggunakan
2 L etanol 70. Hasil dari maserasi disaring dan sisa ampasnya diremaserasi dengan perlakuan yang sama seperti maserasi pertama. Hasil saringan dari
maserasi pertama dan hasil remaserasi digabungkan, lalu dimasukan kedalam labu alas bulat dan diuapkan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator dengan
suhu 60-70
o
C. Pelarut ekstrak yang sudah diuapkan dengan vacuum rotary evaporator
kemudian diuapkan kembali menggunakan waterbath hingga bobot dari ekstrak daun jambu biji mengalami penurunan bobot sebesar 10. Ekstrak
kental daun jambu biji yang dihasilkan memiliki konsistensi cair. Ekstrak kental daun jambu biji kemudian disimpan kedalam lemari pendingin.
2. Uji kualitatif tanin dalam ekstrak daun jambu biji
Ekstrak daun jambu biji diambil sebanyak ± 2 ml ke dalam tabung reaksi. Sebanyak tiga tetes FeCl
3
ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Tanin yang
terhidrolisis akan memberikan warna biru atau biru kehitaman, sedangkan tanin yang terkondensasi akan menghasilkan warna biru hijau Maulana, 2014.
3. Uji daya antibakteri ekstrak daun jambu biji
a. Pembuatan stok bakteri Staphylococcus aureus
Sebanyak 7,6 gram media Muller Hinton Agar MHA disuspensikan ke dalam 200 mL aquadest. Sebanyak 5 ml media Muller Hinton Agar MHA
dimasukkan kedalam tabung reaksi setelah itu disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit. Tabung reaksi dimiringkan pada kemiringan 30-45
dan dibiarkan memadat. Sebanyak satu ose biakan murni Staphylococcus aureus
diinokulasi ke dalam media agar miring secara zig-zag kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37
C. b.
Pembuatan suspensi bakteri Staphylococcus aureus Sebanyak satu ose koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari
stok bakteri yang telah dibuat pada agar miring kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi yang telah berisi NaCl 0,9 steril secara aseptis. Kekeruhan
suspensi bakteri Staphylococcus aureus disesuaikan dengan kekeruhan standard 0,5 McFarland 1,5x10
8
CFUmL. c.
Pengujian potensi antibakteri ekstrak daun jambu biji Media MHA steril dituang kedalam cawan petri dan ditunggu hingga
memadat. Suspensi bakteri Staphylococcus aureus diambil menggunakan cotton bud
steril dan dioleskan terhadap permukaan media MHA hingga merata. Pelubangan dilakukan terhadap media hingga sampai ke dasar
menggunakan pelubang sumuran. Larutan 5 ekstrak daun jambu biji diambil
menggunakan spuit dan diletakkan kedalam lubang sumuran secara aseptis. Cawan petri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
C di dalam inkubator. Zona hambat yang dihasilkan oleh 5 ekstrak daun jambu biji diukur.
Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
4. Formula krim ekstrak daun jambu biji
Formula krim yang dipilih sebagai dasar pembuatan krim ekstrak daun jambu biji mengacu pada formula krim antibakteri ekstrak O. Corniculata yang
diteliti oleh Handali, Hosseini, Ameri, and Moghimipour 2011 dengan komposisi sebagai berikut :
R Asam stearat 1 g
Spermaceti 0,5 g
Setil alkohol 0,5 g
Gliserin 0,5 g
Trietanolamin 0,2 g
Benzyl alcohol 0,2 g
O. corniculata extract 0,1 g
Aquadest 7 ml
Formula krim yang akan digunakan dalam penelitian sebanyak 100 g, sehingga komposisi formula dimodifikasi sebagai berikut :
R Asam stearat 20 g
Tween 80 4-6 g
Butylated hydroxytoluene 0,02 g
Sorbitol 6-9 g
Trietanolamin 2 g
Metil paraben 0,03 g
Ekstrak daun jambu biji 5 g
Aquadest 60 ml
Optimasi formula krim dilakukan dalam penelitian ini. Optimasi formula dilakukan pada penggunaan Tween 80 sebagai emulsifying agent dengan level
rendah sebesar 4 gram dan level tinggi sebesar 6 gram serta sorbitol sebagai humektan dengan level rendah sebesar 6 gram dan level tinggi sebesar 9 gram.
Jumlah masing-masing bahan yang digunakan pada tiap formula dapat dilihat pada tabel II.
Tabel II. Formula krim ekstrak daun jambu biji
Komposisi Formula g
F
1
F
a
F
b
F
ab
Ekstrak daun jambu biji 5
5 5
5 Asam stearat
20 20
20 20
Tween 80 4
6 4
6
Butylated hydroxytoluene 0,02
0,02 0,02
0,02 Sorbitol
6 6
9 9
Trietanolamin 2
2 2
2 Metil paraben
0,03 0,03
0,03 0,03
Aquadest 60
60 60
60
5. Pembuatan krim ekstrak daun jambu biji
Masing-masing fase dipanaskan pada suhu yang sama 70 C, yaitu asam
stearat dan butylated hydroxytoluene sebagai fase minyak, serta Tween 80, sorbitol, trietanolamin, metil paraben dan aquadest sebagai fase air. Fase minyak
yang telah dipanaskan dimasukkan ke dalam wadah yang hangat, setelah itu dicampur dengan fase air. Ekstrak daun jambu biji ditambahkan ke dalam
campuran krim setelah campuran membentuk massa krim. Pencampuran
dilakukan di dalam mixer dengan kecepatan konstan selama 2 menit. 6.
Evaluasi sediaan krim ekstrak daun jambu biji
a. Pengujian organoleptis dan pH krim ekstrak daun jambu biji
Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati warna dan bau dari krim setelah 48 jam pembuatan. Pengukuran pH dilakukan dengan
menggunakan indikator pH universal pH stick dengan cara memasukkan pH universal ke dalam sediaan krim ekstrak daun jambu biji kemudian pH
krim ditentukan. b.
Penentuan tipe emulsi dengan metode pewarnaan Sejumlah krim dioleskan pada gelas objek kemudian ditambakan 1
tetes methylene blue dan diamati secara mikroskopik. Fase air ditunjukkan dengan warna biru, sedangkan bagian yang tidak berwarna merupakan fase
minyak. Krim dengan tipe MA atau tipe AM ditentukan dengan melihat warna yang terbentuk pada pengamatan mikroskopik.
c. Pengujian ukuran droplet
Sejumlah krim dioleskan pada gelas objek dan ditutup menggunakan kaca penutup, kemudian diletakkan dibawah mikroskop.
Ukuran droplet yang terdispersi dalam krim diamati. Sebanyak 500 droplet diamati menggunakan perbesaran kuat.
d. Pengujian viskositas
Krim dimasukkan ke dalam wadah dan dipasang pada viscotester Rion VT-04.
Viskositas krim ditentukan dengan cara mengambil 100 g krim pada masing-masing formula dan viskositas diukur menggunakan
viscotester VT-04 pada suhu 37
C. Nilai viskositas krim ditunjukkan oleh jarum penunjuk saat viscotester dinyalakan. Pengujian dilakukan selama 48
jam, 14 hari, 21 hari dan 28 hari. e.
Pengujian daya sebar Uji daya sebar krim ekstrak daun jambu biji dilakukan setelah 48
jam pembuatan krim. Uji daya sebar dilakukan dengan menimbang massa krim sebanyak 1 gram, kemudian diletakkan di tengah kaca bulat berskala.
Diletakkan pemberat 125 gram diatas kaca bulat berskala dan didiamkan selama 1 menit. Setelah didiamkan selama 1 menit, diameter penyebaran
krim diukur. Pengujian daya sebar dilakukan selama 48 jam setelah pembuatan, 14 hari, 21 hari dan 28 hari.
f. Uji iritasi
Uji iritasi dilakukan menggunakan metode HET-CAM Hen’s Egg
Test on the Chorioallantoic Membran . Telur ayam yang berusia 10 hari
disiapkan untuk pengujian HET-CAM. Bagian cangkang telur yang berisi rongga udara dibuka secara hati-hati. Bagian membran dalam telur dicuci
atau dibilas menggunakan NaCl 0,9 hingga berwarna transparan. Kontrol positif yang digunakan yaitu NaOH 0,1N, sedangkan kontrol negatif yang
digunakan yaitu NaCl 0,9. Bagian membran dalam telur dipisahkan
dengan Chorioallantoic membran CAM secara perlahan. Dipejankan masing-masing sebanyak 0,3 mL untuk kontrol positif NaOH 0,1N dan
kontrol negatif NaCl 0,9 kedalam telur yang terdapat pembuluh darah, sedangkan dipejankan sebanyak 0,3 gram krim ekstrak daun jambu biji
kedalam telur yang terdapat pembuluh darah sebagai perlakuan. Perubahan reaksi yang terjadi terhadap telur diamati selama 5 menit.
Tabel III. Hubungan antara score yang didapat dari persamaan IS dengan kategori
iritasi Cazedey,
Carvalho, Fiorentino, Gremião, and Salgado, 2009
Irritation Score Kategori
0-0,9 Tidak mengiritasi
1-4,9 Sedikit mengiritasi
5-8,9 Cukup mengiritasi
9-21 Sangat mengiritasi
Perubahan reaksi yang timbul dapat berupa perdarahan hemorrhage, lisis lysis, dan koagulasi coagulation. Data yang
didapatkan setelah perlakuan diaplikasikan pada persamaan Irritation Score IS:
Irritation Score IS =
301 −�
300
� 5 +
301 −�
300
� 7 +
301 −�
300
� 9 Di mana :
HT Hemorrhage time = waktu pertama kali munculnya pembuluh darah
mengalami perdarahan detik. LT Lysis time
= waktu pertama kali munculnya lisis pembuluh darah detik.
CT Coagulation time = waktu pertama kali munculnya koagulasi protein
detik. Hasil dari IS dari perhitungan kemudian dicocokkan dengan tabel
III untuk mengetahui kategori iritasi pada masing-masing kelompok perlakuan senyawa uji.
G. Analisis Hasil
Analisis data utama berupa data sifat fisis respon viskositas dan daya sebar serta stabilitas fisik pergeseran viskositas dan daya sebar dilakukan
menggunakan softwareR 3.1.1 dengan berbagai uji statistik di dalamnya. Uji statistik yang akan dilakukan antara lain uji Shapiro-Wilk untuk melihat
normalitas penyebaran data, uji Levene’s test untuk melihat kesamaan varians. Data hasil uji statistik yang memenuhi persyaratan uji parametrik uji normalitas
dan uji kesamaan varians berupa p-value 0,05 akan dilanjutkan dengan uji ANOVA. Uji ANOVA dilakukan untuk melihat pengaruh yang dominan antara
Tween 80, sorbitol atau interaksi keduanya dalam menentukan respon sifat fisis krim dan stabilitas fisik krim ekstrak daun jambu biji. Hal ini dapat ditunjukkan
dengan p-value. Data yang tidak memenuhi persyaratan uji parametrik dilanjutkan dengan uji non-parametrik Kruskal-Wallis dengan post hoc Wilcoxon. Seluruh uji
statistik dilakukan dengan taraf kepercayaan 95. Data yang didapat selain data utama berupa hasil uji organoleptis, uji pH,
uji tipe krim, uji ukuran droplet, uji iritasi menggunakan metode HET-CAM serta uji antibakteri ekstrak daun jambu biji dapat digunakan sebagai data pendukung.
Uji organoleptis dan uji pH dilakukan dengan pengamatan visual. Uji tipe krim
dan uji ukuran droplet dilakukan dengan menggunakan mikroskop. Uji iritasi dengan metode HET-CAM dilakukan dengan pengamatan visual, kemudian hasil
dari uji iritasi ditentukan menggunakan tabel irritation score untuk mengetahui indeks iritasi dari ekstrak daun jambu biji. Uji antibakteri ekstrak daun jambu biji
dilakukan secara kualitatif dengan melihat ada atau tidaknya zona hambat yang terbentuk, serta secara kuantitatif dengan mengukur luas zona hambat yang
terbentuk.
31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Ekstrak Daun Jambu Biji
Daun jambu biji segar diperoleh dari Merapi Farma. Daun jambu biji dibuat menjadi serbuk untuk memperluas kontak permukaan antara penyari
dengan serbuk daun jambu biji sehingga senyawa yang diinginkan lebih banyak terambil. Ekstraksi daun jambu biji dilakukan dengan menggunakan metode
maserasi. Metode maserasi digunakan karena cukup mudah dilakukan dan dapat mengekstrak tanin yang terkandung dalam serbuk daun jambu biji segar.
Serbuk ditimbang sebanyak 500 gram dan dicampur dengan penyari etanol 70 didalam erlenmeyer. Etanol 70 dipilih sebagai penyari karena tanin
merupakan senyawa yang larut dalam air. Oleh sebab itu digunakan campuran etanol-air untuk dapat mengambil tanin yang terdapat dalam serbuk daun jambu
biji. Etanol digunakan untuk dapat menembus sel-sel dari serbuk daun jambu biji sehingga tanin yang terperangkap dalam sel-sel serbuk daun jambu biji dapat
didapatkan dengan bantuan air yang terkandung dalam etanol 70. Serbuk yang telah dicampur dengan etanol 70 kemudian diletakkan
diatas shaker dan didiamkan selama 3 hari. Setelah 3 hari erlenmeyer dikeluarkan dari shaker kemudian disaring menggunakan kertas saring. Remaserasi dilakukan
terhadap serbuk daun jambu biji yang tertinggal pada saringan untuk mendapatkan lebih banyak senyawa yang diinginkan. Hasil dari remaserasi disaring
menggunakan kertas saring, kemudian digabung dengan hasil dari maserasi. Hasil dari maserasi dan remaserasi kemudian diuapkan menggunakan vacuum rotary
