BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan post test only control group design untuk menguji toksisitas dari ekstrak metanol
daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode BSLT.
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari 2013 sampai bulan Agustus 2013 di Laboratorium Farmasi dan Laboratorium Biologi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.3 Populasi dan Sampel
3.3.1 Populasi Populasi pada penelitian ini adalah larva Artemia salina Leach.
3.3.2 Sampel 3.3.2.1. Kriteria inklusi
Larva Artemia salina Leach berumur 48 jam sebagai hewan uji.
3.3.2.2. Kriteria eksklusi
Larva Artemia salina Leach yang tidak menunjukkan aktivitas pergerakan sebelum perlakuan.
3.3.2.3. Besar sampel
Jumlah larva Artemia salina Leach yang digunakan adalah 10 ekor larva untuk tiap konsentrasi ekstrak. Pada penelitian ini terdapat
lima konsentrasi dan satu kontrol negatif. Kemudian dilakukan replikasi tiga kali triplo untuk tiap konsentrasi dan kontrol negatif.
Jadi, jumlah sampel total yang diperlukan adalah 180 ekor larva Artemia salina Leach setiap kali perlakuan.
27
3.3.2.4. Cara pengambilan sampel
Sampel diambil secara purposive random sampling. Larva Artemia salina Leach dengan jenis dan cara penyediaan yang sama
sehingga mempunyai kesempatan yang sama untuk diseleksi sebagai sampel. Hal ini karena anggota populasi telah bersifat
homogen.
36
3.4 Determinasi Tanaman
Identifikasi atau determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense, Balai Penelitian dan Pengembangan Botani Pusat Penelitian dan
Pengembangan Biologi, LIPI Bogor. Dengan melakukan determinasi, maka dapat menetapkan kebenaran yang berkaitan dengan struktur dan
morfologi secara makroskopis tanaman daun Garcinia benthami Pierre terhadap kepustakaan.
3.5 Bahan yang Diuji
6 kg daun basah Garcinia benthami Pierre yang diperoleh dari Kebun Raya Bogor. Penyiapan bahan ini dilakukan dengan memisahkan
daun dari tangkainya dan membersihkan daun dari sisa-sisa tanah dan kotoran kemudian dicuci dengan air yang bersih dan mengalir. Kemudian
daun dikeringkan di Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik Balitro,Bogor. Daun yang telah kering, dihaluskan dengan menggunakan
blender sampai berbentuk serbuk halus. Didapatkan 1 kg serbuk halus simplisia kering daun Garcinia benthami Pierre yang akan digunakan
untuk membuat ekstrak.
3.6 Alat dan Bahan Penelitian
3.6.1 Alat Penelitian
1. Rotary evaporator 2. Batang pengaduk
3. Corong 4. Gelas ukur 10 mL
28
5. Mikropipet 6. Neraca analitik
7. Pipet tetes 8.
Tabung reaksi 9. Seperangkat alat penetasan telur wadah plastik dan
sterofoam 10.
Cawan penguap 11.
Labu ukur 12.
Bejana kaca maserasi 13.
Lup 14.
Cawan petri 15.
Kaca arloji
3.6.2 Bahan Penelitian
1. Air laut 2. Akuades
3. Aluminium foil 4. serbuk kering daun Garcinia benthami Pierre
5. Kertas saring 6. Pelarut metanol
7. Telur udang Artemia salina Leach yang diperoleh dari LIPI, Bogor
3.7 Cara Kerja Penelitian
3.7.1 Ekstraksi Daun Garcinia benthami Pierre dengan Maserasi
Metode ekstraksi dilakukan secara maserasi. Simplisia daun yang sudah berbentuk serbuk kering dan halus sebanyak 1000 gram dimasukkan
ke dalam bejana kaca maserasi. Sampel yang telah ditimbang lalu direndam dengan n-heksana dan dimaserasi. Kemudian hasil rendaman
disaring untuk memisahkan filtrat dan ampasnya. Perendaman dilakukan sampai filtrat mendekati bening. Filtrat dipekatkan dengan rotary
evaporator sehingga didapatkan ekstrak n-heksana. Kemudian ampas
29
diangin-anginkan agar terbebas dari pelarut n-heksana. Ampas kering direndam dengan etil asetat. Melakukan penyaringan kembali dan filtrat
dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak etil asetat.
37
Ampas hasil rendaman etil asetat, diangin-anginkan kembali agar pelarut etil asetat menguap. Setelah ampas kering, lalu dituang ke bejana
dan direndam dengan 6 liter pelarut metanol yang telah di destilasi. Maserasi dilakukan selama 5 hari dan terlindung dari cahaya. Dilakukan
pengadukan beberapa kali sehari agar pelarut masuk ke seluruh permukaan serbuk simplisia dan meratakan konsentrasi larutan. Setelah 5 hari, maka
dilakukan penyaringan dan diambil filtratnya. Selanjutnya filtrat dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 45
C hingga didapatkan ekstrak kental metanol daun Garcinia benthami Pierre. Filtrat dituang
dalam cawan penguap, kemudian diuapkan di dalam lemari asam. Hasil akhir didapatkan ekstrak kental metanol daun Garcinia benthami Pierre
sebanyak 15,5 gram.
Gambar 3.1 Bagan Alur Ekstraksi Daun Garcinia benthami Pierre
6 kg daun basah Garcinia benthami Pierre dibersihkan dan dikeringkan
dihaluskan dengan blender dan disaring 1 kg serbuk kering daun Garcinia benthami Pierre
maserasi dengan pelarut n-heksana, disaring dan dievaporasi
ekstrak n-heksana ampas
maserasi dengan pelarut etil asetat, disaring dan dievaporasi
ekstrak etil asetat ampas
maserasi dengan pelarut metanol, disaring dan dievaporasi
ekstrak metanol uji toksisitas akut
dengan metode BSLT ampas
: dikerjakan oleh peneliti : dikerjakan oleh rekan peneliti
keterangan bagan : 30
3.7.2 Penetasan Larva Udang
Wadah plastik disiapkan untuk penetasan telur udang. Wadah dibagi menjadi dua bagian, yaitu ruang terang dan ruang gelap. Kedua
bagian tersebut dibatasi dengan sterofoam yang pada tepi bawahnya telah dilubangi sebagai tempat keluarnya telur yang telah menetas.
Memasukkan 1 liter air laut ke dalam wadah hingga kedua lubang pada sterofoam terendam. Salah satu ruang dalam wadah tersebut diberi
penerangan dengan cahaya lampu pijarneon untuk menghangatkan suhu dalam penetasan dan merangsang proses penetasan. Untuk penerangan,
lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan telur. Untuk ruangan yang satunya, diisi 1 gram telur udang di bagian gelap tanpa penyinaran
ditutup dengan aluminium foil dan lakban hitam. Setelah 48 jam, telur akan menetas menjadi larva dan akan bergerak secara alamiah menuju
ruang terang. Larva yang sehat bersifat fototropik dan dapat dijadikan hewan uji pada metode BSLT.
38
Pada proses penetasan dilakukan dalam kondisi yang sama yaitu air laut yang digunakan dengan pH sekitar 8-9
dan penerangan cahaya lampu yang sesuai untuk penetasan telur.
3.7.3 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak yang Akan Diuji
Melakukan trial atau orientasi dengan uji coba untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak yang efektif membunuh larva Artemia salina Leach,
yaitu dengan menggunakan konsentrasi desimal, yaitu 1, 0,5, 0,2, 0,1, dan 0,05. Konsentrasi ekstrak yang digunakan yaitu 1000 ppm,
500 ppm, 200 ppm, 100 ppm, dan 50 ppm.
33
Ekstrak kental metanol daun Garcinia benthami Pierre ditimbang menggunakan neraca analitik hingga mencapai berat 250 mg. Melarutkan
250 mg ekstrak dengan akuades secukupnya. Setelah larut, kemudian dituangkan ke dalam labu ukur 250 mL dan menambahkan akuades hingga
batas yang tertera di labu ukur. Larutan uji dihomogenkan dengan cara membolak-balik labu ukur. Larutan uji yang didapatkan yaitu larutan
induk dengan konsentrasi 1000 ppm. Selanjutnya membuat larutan uji
31
dengan konsentrasi 500 ppm, 200 ppm, 100 ppm, dan 50 ppm dengan menggunakan rumus pengenceran:
V
1
M
1
=V
2
M
2
keterangan : V
1
= volume awal M
1
= konsentrasi awal V
2
= volume akhir M
2
= konsentrasi akhir
3.7.4 Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT.
5 buah tabung reaksi disiapkan sebagai media uji. Menuangkan 5 mL air laut ke dalam masing-masing tabung reaksi. Memindahkan
sebagian larva Artemia salina Leach berumur 48 jam ke dalam cawan petri untuk memudahkan pengambilan larva. Pada masing-masing tabung reaksi,
dituangkan 10 larva udang menggunakan pipet tetes. Untuk memudahkan pengamatan, maka digunakan lup. Setelah itu, meneteskan 1 mL ekstrak
pada tabung reaksi menggunakan mikropipet. Kemudian, menambahkan air laut sehingga volume dalam masing-masing tabung reaksi menjadi 10
mL. Tabel 3.1 Data Konsentrasi Ekstrak pada Tabung Reaksi
Tabung reaksi I
Tabung reaksi II Tabung reaksi
III Tabung reaksi
IV Tabung reaksi V
10 larva udang + 1
mL konsentrasi
ekstrak 1000 ppm
+ 9 mL air laut
10 larva udang + 1 mL konsentrasi
ekstrak 500 ppm + 9 mL air laut
10 larva udang + 1 mL konsentrasi
ekstrak 200 ppm + 9 mL air laut
10 larva udang + 1 mL konsentrasi
ekstrak 100 ppm + 9 mL air laut
10 larva udang + 1 mL konsentrasi
ekstrak 50 ppm + 9 mL air laut
Masing-masing tabung reaksi ditutup atasnya dengan alumunium foil yang sedikit dilubangi untuk aliran udara. Dilakukan 3 kali
pengulangan triplo pada setiap konsentrasi. Dilakukan pengadukan agar
32
larutan menjadi homogen. Menyiapkan kontrol negatif, yaitu tabung reaksi yang berisi air laut dan 10 larva udang tanpa penambahan larutan ekstrak.
Setelah itu, larutan dibiarkan selama 24 jam. Setelah 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang masih hidup pada masing-masing tabung
reaksi. Kriteria standar untuk mengukur kematian larva udang yaitu apabila larva udang tidak menunjukkan pergerakan selama beberapa detik
pengamatan. Perhitungan larva secara manual yaitu dengan mengamati larva di dalam tabung reaksi dengan bantuan lup, kemudian diamati dalam
kaca arloji dengan bantuan cahaya. Jumlah larva yang mati dihitung dengan mengurangkan jumlah total larva pada tiap konsentrasi dengan
jumlah larva yang masih hidup.
33,39
3.8 Alur Penelitian
Gambar 3.2 Bagan Alur Penelitian
1 gram telur Artemia salina Leach Penetasan telur Artemia salina Leach
Larva Artemia salina Leach berumur 48 jam Larva Artemia salina Leach dengan jenis dan cara penyediaan yang sama
dan telah bersifat homogen Pengambilan larva secara random
kontrol - : 10 larva+10 mL air laut tabung reaksi I : 10 larva+1 mL konsentrasi ekstrak 1000 ppm+9 mL air laut
tabung reaksi II : 10 larva+1 mL konsentrasi ekstrak 500 ppm+9 mL air laut tabung reaksi III : 10 larva+1 mL konsentrasi ekstrak 200 ppm+9 mL air laut
tabung reaksi IV : 10 larva+1 mL konsentrasi ekstrak 100 ppm+9 mL air laut tabung reaksi V : 10 larva+1 mL konsentrasi ekstrak 50 ppm+9 mL air laut
volume akhir pada masing-masing tabung reaksi adalah 10 mL dilakukan replikasi 3 kali pada tiap konsentrasi
24 jam setelah pemberian ekstrak, dilakukan perhitungan jumlah larva yang masih hidup
diketahui jumlah larva yang mati menghitung persentase kematian larva pada tiap konsentrasi
menentukan nilai LC
50
dengan metode probit 33
3.9 Pengolahan dan Analisis Data
Kategori