19
d. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini yaitu kematian sel
HeLa - sel Vero secara alami dan umur tumbuhan rumput teki.
2. Definisi operasional
a. Uji sitotoksisitas adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan kultur
sel HeLa dan sel Vero. b.
Fraksi protein FP protein fraction PF adalah bagian dari tumbuhan yang berisi protein yang didapat dengan cara menambahkan amonium
sulfat pada derajat kejenuhan tertentu. c.
LC
50
adalah konsentrasi fraksi protein yang dibutuhkan untuk membunuh sebanyak 50 populasi sel uji.
C. Alat dan Bahan
1. Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas, stamper, mortir, timbangan analitik AND ER-400 H, alumunium foil, magnetic
stirrer , tabung conical, autoklaf, tissue culture flask, swing rotor sentrifuge PLC,
inkubator Nuaire, mikropipet, membran dialisis Sigma, lemari pendingin, cell counter
Nunc, 96-well plate Nunc, spektrofotometer UV Cecil CE-292, ELISA reader
SLT 340 ATC, laminar air flow Nuaire, mikroskop Olympus IMT-2, haemocytometer
Nebauer, kain monel, gloves, masker, autoklaf, dan freezer.
2. Bahan
a. Sampel umbi rumput teki yang diambil di daerah Sumberarum, Moyudan, Sleman tepi Sungai Progo pada bulan Juli 2006.
20
b. Kultur sel HeLa dan sel Vero yang diambil dari stok Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
c. Pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi fraksi protein umbi rumput teki yaitu :
1 Larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 Merck
2 Larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14
M NaCl Merck 3
Amonium sulfat Merck
d. Pereaksi-pereaksi untuk uji sitotoksisitas 1
Medium pencuci: RPMI 1640 Sigma, natrium bikarbonat, Hepes 2
Bahan untuk isolasi sel Vero: tripsin 0,25 3
Medium penumbuh: RPMI 1640, FBS Fetal Bovine Serum 10, Penisilin-Streptomisin 1 Gibco, dan Fungison 0,5 Gibco.
4 Reagen Stopper : SDS sodium dodeksil sulfat dalam HCl 0,01 N
Merck 5
MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide dalam media RPMI 1640 untuk sel HeLa dan media M199 untuk sel
Vero Sigma
D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tumbuhan
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu umbi rumput teki. Tumbuhan rumput teki terlebih dahulu dideterminasi di laboratorium Farmakognosi
21
Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan telah dipastikan pula kebenarannya menggunakan acuan baku Flora of Java Backer dan
Backuizen van den Brink, 1968.
2. Pengumpulan umbi rumput teki
Umbi rumput teki untuk penelitian ini diambil dari Tepi Sungai Progo, Moyudan, Sleman, Yogyakarta.
3. Sterilisasi alat dan bahan
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat
tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
C Anonim, 1995.
4. Preparasi fraksi protein dari umbi rumput teki
Bahan umbi rumput teki dikumpulkan segar, diseleksi kemudian dicuci bersih dengan air mengalir. Umbi dipotong kecil-kecil, kemudian dimasukkan dalam
plastik dan disimpan dalam freezer selama dua malam. Umbi ditimbang sebanyak 400 g gram kemudian ditumbuk halus sambil ditambahkan sesedikit mungkin dapar
natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu ±4ºC. Kemudian diperas dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih
dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifugasi dengan 2010 xG selama 20 menit. Supernatan dikumpulkan dalam beaker glass 1000 ml dan diendapkan proteinnya
dengan menambahkan 79,8 g amonium sulfat, stirrer semalam. Kemudian disentrifus PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
lagi 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Supernatan 1 ditampung dalam beaker glass 1000 ml sedangkan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit
mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 tanpa NaCl; kemudian didialisis dengan tabung dialisis dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 selama
semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu 4°C. Pelet kemudian dibuang dan supernatan merupakan fraksi protein umbi rumput teki FP
20
. Supernatan 1 kemudian ditambah dengan 74,2 g amonium sulfat, stirrer
semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 30 menit pada suhu ±4°C. Supernatan 2 ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit
mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Pelet
dibuang dan supernatan merupakan sampel fraksi protein umbi rumput teki FP
40
. Supernatan 2 kemudian ditambah dengan 87,22 g amonium sulfat, stirrer
semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 30 menit pada suhu ±4°C. Supernatan 3 ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit
mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Pelet
dibuang dan supernatan merupakan sampel fraksi protein umbi rumput teki FP
60
. Supernatan 3 kemudian ditambah dengan 98,8 g amonium sulfat, stirrer
semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 30 menit pada suhu ±4°C. Supernatan ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin
larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2; kemudian didialisis selama semalam. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel fraksi protein umbi rumput teki FP
80
.
5. Pengukuran kadar protein dengan matode spektrofotometri UV
Fraksi protein umbi rumput teki FP
20
, FP
40
, FP
60
, dan FP
80
masing-masing sebanyak 10µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl larutan dapat
natrium fosfat 5mM. Ukur serapan absorbansi menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280nm dan 260nm dengan blanko larutan dapar natrium
fosfat. Data absorbansi tiap-tiap fraksi protein umbi rumput teki kemudian dihitung
dengan rumus berikut ini untuk mendapatkan kadar protein dalam mgml.
Layne, 1957 cit Richterich Colombo, 1981
6. Preparasi sel HeLa
a. Propagasi sel HeLa. Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian
segera dicairkan dalam penangas air 37
o
C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel HeLa dipindahkan dalam tabung conical steril
yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifuse 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian
disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifuse 2010 xG kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1
ml medium penumbuh yang mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan
Kadar protein mgml = [1,55 E
280
] – [0,76 E
260
] mgml PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan
jumlahnya cukup untuk penelitian. b.
Panen sel HeLa. Setelah jumlah sel cukup, media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara
diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifuse 2010
xG selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer.
Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3x10
4
100 μl dan siap dipakai untuk penelitian.
7. Preparasi Sel Vero
a. Propagasi sel Vero. Sel diambil dari nitogen cair, segera dicairkan dalam
penangas air 37º C, kemudian ampul disemprot dengan etanol cair 70. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung steril yang berisi medium M199.
Suspensi sel disentrifuse 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti M199 baru, disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel disentrifuse lagi 2010 xG selama 5
menit, cuci ulang, supernatan dibuang. Sel ditambah 1ml medium pertumbuhan yang mengandung 10 PBS dan diresuspensikan sehingga homogen. Kemudian sel
ditumbuhkan dalam beberapa buah tabung biakan kecil, diinkubasikan dalam inkubator aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut.
25
b. Panen sel Vero. Setelah jumlah sel cukup siap panen, sel dicuci dengan
fBS satu kali sebanyak 3 ml. Kemudian diberi tripsin 0,25 sebanyak 1ml untuk melepaskan sel-sel. Setelah itu dituang dalam conical steril yang sudah berisi M199
sebanyak 7 ml, bilas dengan 3ml FBS 10. Hasil bilasan dituang ke conical yang sama, sentrifuse 2010 xG selama 5 menit. Sel dicuci 1x lagi dengan menggunakan
medium yang sama untuk menghilangkan sisa tripsin. Pelet ditambah media kultur sebanyak 1ml, dihitung jumlah selnya dengan menggunakan haemocytometer.
Suspensi sel ditambah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3x10
4
sel100µl dan siap digunakan.
8. Uji sitotoksisitas fraksi protein umbi rumput teki
a. Sel HeLa. Sebanyak 100
μl suspensi sel HeLa dengan kepadatan 3x10
4
100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang telah berisi
100 μl fraksi protein umbi teki dengan kadar 200 µgml pada sumuran A
1
, B
1
dan C
1
pada kolom 1, kemudian pada sumuran A
2
, B
2
dan C
2
di kolom 2 ditambahkan 100 μl suspensi sel HeLa pada sumuran yang telah berisi 100 μl fraksi protein umbi
rumput teki dengan kadar 100 µgml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Kemudian diinkubasi
bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi pembacaan dilakukan 3 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 6 baris sumuran. Sebagai
kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 , sedangkan untuk faktor koreksi,
100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37
o
C, dalam inkubator dengan aliran 5 CO
2
. Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10
μl MTT 2,5
μgml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37
o
C, dalam inkubator dengan aliran CO
2
5. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100
μl reagen stopper
pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya
serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. b. Sel Vero. Uji sitotoksisitas fraksi protein umbi rumput teki pada sel Vero
dilakukan dengan menggunakan langkah yang sama dengan uji sitotoksisitas pada sel HeLa. Perbedaannya hanya terletak pada media yang digunakan, yakni menggunakan
M199 untuk sel Vero.
E. Analisis Hasil
Pada uji sitotoksisitas dengan menggunakan metode MTT ini, serapan absorbansi terbaca menunjukkan jumlah sel yang hidup. Hasil akhir uji
sitotoksisitas yaitu persentase kematian sel yang dihitung menggunakan modifikasi rumus Abbot, dengan persamaan berikut:
Kematian sel = 100
x A
C B
A −
− PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Keterangan : A = Rata-rata absorbansi kontrol
B = Rata-rata absorbansi perlakuan C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel
Meyer et al, 1982 ; cit Candra, 2006 Perhitungan statistika dilakukan dengan menggunakan analisis probit untuk
mengetahui harga LC
50
, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan uji t- independent
untuk melihat perbedaan harga LC
50
antara sel HeLa dan sel Vero. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN
A. Determinasi Tumbuhan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah umbi rumput teki Cyperus rotundus L.. Untuk mencegah terjadinya kesalahan dan menjamin bahwa
yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar-benar Cyperus rotundus L., maka terlebih dahulu dilakukan determinasi menurut Backer dan Brink Jr 1968.
Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Dari determinasi didapat kunci Cyperaceae
1b-2a-3b-4b-6b-7a-8a-11. Cyperus -1b-2b-15b-17b-19b-27b-37b-38b-39b-42b-43b- 44a-45b-46a-Cyperus rotundus L. Hasil determinasi menyatakan bahwa tumbuhan
yang digunakan dalam penelitian adalah benar Cyperus rotundus L.
B. Pengumpulan Umbi Rumput Teki
Pada umumnya, rumput teki tumbuh mengumpul membentuk rumpun. Umbi rumput teki yang merupakan bahan utama dalam penelitian ini diambil dari
daerah Sumberarum, Moyudan, Sleman tepi Sungai Progo, Yogyakarta pada bulan Juli 2006. Umbi yang telah dikumpulkan kemudian dibersihkan dari tanah, kerikil,
ataupun benda asing lain yang terbawa pada saat pengumpulan umbi rumput teki.
C. Sterilisasi Alat dan Bahan Penelitian
Sebelum memulai penelitian, terlebih dahulu dilakukan sterilisasi alat-alat yang akan digunakan selama penelitian. Hal ini dilakukan untuk mencegah adanya
kontaminasi, baik dari mikroorganisme maupun senyawa-senyawa asing lain yang
28 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
dapat mempengaruhi hasil penelitian. Alat-alat tersebut dikumpulkan, dicuci bersih dengan sabun, dikeringkan, dan dibungkus dengan alumunium foil kemudian
disterilisasi. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
C. Prinsip kerja autoklaf adalah menggunakan uap panas bertekanan yang dapat menyebabkan koagulasi dan denaturasi protein pada bakteri.
D. Preparasi Sampel Fraksi Protein Umbi Rumput Teki
Senyawa uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah fraksi protein umbi rumput teki. Umbi rumput teki segar yang telah dipanen dicuci bersih dengan air
mengalir untuk menghilangkan berbagai pengotor yang kemungkinan besar masih menempel. Umbi rumput teki kemudian dipotong kecil-kecil dan disimpan dalam
freezer semalaman yang dimaksudkan untuk mempermudah penumbukan bahan.
Sebanyak 400 g umbi rumput teki ditumbuk halus dalam mortir diatas wadah berisi es dengan penambahan sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM yang
mengandung NaCl. Dapar ini berfungsi untuk mengekstraksi protein dari selnya dan NaCl berfungsi untuk mempermudah proses ekstraksi dan melarutkan protein serta
membuatnya stabil dalam buffer pengekstrak. Semua proses dilakukan pada suhu rendah ±4ºC untuk mencegah denaturasi dan reaksi enzim proteolisis yang dapat
merusak protein umbi. Selanjutnya, bahan diperas menggunakan kain monel dan cairan yang diperoleh disentrifugasi 2010 xG selama 20 menit. Dari proses
sentrifugasi diperoleh supernatan yang merupakan ekstrak gubal umbi rumput teki. Protein dalam ekstrak gubal umbi rumput teki selanjutnya diendapkan
secara bertingkat dengan amonium sulfat lampiran 2. Penambahan amonium sulfat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
