22
lagi 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Supernatan 1 ditampung dalam beaker glass 1000 ml sedangkan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit
mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 tanpa NaCl; kemudian didialisis dengan tabung dialisis dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 selama
semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu 4°C. Pelet kemudian dibuang dan supernatan merupakan fraksi protein umbi rumput teki FP
20
. Supernatan 1 kemudian ditambah dengan 74,2 g amonium sulfat, stirrer
semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 30 menit pada suhu ±4°C. Supernatan 2 ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit
mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Pelet
dibuang dan supernatan merupakan sampel fraksi protein umbi rumput teki FP
40
. Supernatan 2 kemudian ditambah dengan 87,22 g amonium sulfat, stirrer
semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 30 menit pada suhu ±4°C. Supernatan 3 ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit
mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Pelet
dibuang dan supernatan merupakan sampel fraksi protein umbi rumput teki FP
60
. Supernatan 3 kemudian ditambah dengan 98,8 g amonium sulfat, stirrer
semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 30 menit pada suhu ±4°C. Supernatan ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin
larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2; kemudian didialisis selama semalam. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel fraksi protein umbi rumput teki FP
80
.
5. Pengukuran kadar protein dengan matode spektrofotometri UV
Fraksi protein umbi rumput teki FP
20
, FP
40
, FP
60
, dan FP
80
masing-masing sebanyak 10µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl larutan dapat
natrium fosfat 5mM. Ukur serapan absorbansi menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280nm dan 260nm dengan blanko larutan dapar natrium
fosfat. Data absorbansi tiap-tiap fraksi protein umbi rumput teki kemudian dihitung
dengan rumus berikut ini untuk mendapatkan kadar protein dalam mgml.
Layne, 1957 cit Richterich Colombo, 1981
6. Preparasi sel HeLa
a. Propagasi sel HeLa. Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian
segera dicairkan dalam penangas air 37
o
C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel HeLa dipindahkan dalam tabung conical steril
yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifuse 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian
disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifuse 2010 xG kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1
ml medium penumbuh yang mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan
Kadar protein mgml = [1,55 E
280
] – [0,76 E
260
] mgml PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan
jumlahnya cukup untuk penelitian. b.
Panen sel HeLa. Setelah jumlah sel cukup, media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara
diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifuse 2010
xG selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer.
Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3x10
4
100 μl dan siap dipakai untuk penelitian.
7. Preparasi Sel Vero
a. Propagasi sel Vero. Sel diambil dari nitogen cair, segera dicairkan dalam
penangas air 37º C, kemudian ampul disemprot dengan etanol cair 70. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung steril yang berisi medium M199.
Suspensi sel disentrifuse 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti M199 baru, disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel disentrifuse lagi 2010 xG selama 5
menit, cuci ulang, supernatan dibuang. Sel ditambah 1ml medium pertumbuhan yang mengandung 10 PBS dan diresuspensikan sehingga homogen. Kemudian sel
ditumbuhkan dalam beberapa buah tabung biakan kecil, diinkubasikan dalam inkubator aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut.
