25
b. Panen sel Vero. Setelah jumlah sel cukup siap panen, sel dicuci dengan
fBS satu kali sebanyak 3 ml. Kemudian diberi tripsin 0,25 sebanyak 1ml untuk melepaskan sel-sel. Setelah itu dituang dalam conical steril yang sudah berisi M199
sebanyak 7 ml, bilas dengan 3ml FBS 10. Hasil bilasan dituang ke conical yang sama, sentrifuse 2010 xG selama 5 menit. Sel dicuci 1x lagi dengan menggunakan
medium yang sama untuk menghilangkan sisa tripsin. Pelet ditambah media kultur sebanyak 1ml, dihitung jumlah selnya dengan menggunakan haemocytometer.
Suspensi sel ditambah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3x10
4
sel100µl dan siap digunakan.
8. Uji sitotoksisitas fraksi protein umbi rumput teki
a. Sel HeLa. Sebanyak 100
μl suspensi sel HeLa dengan kepadatan 3x10
4
100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang telah berisi
100 μl fraksi protein umbi teki dengan kadar 200 µgml pada sumuran A
1
, B
1
dan C
1
pada kolom 1, kemudian pada sumuran A
2
, B
2
dan C
2
di kolom 2 ditambahkan 100 μl suspensi sel HeLa pada sumuran yang telah berisi 100 μl fraksi protein umbi
rumput teki dengan kadar 100 µgml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Kemudian diinkubasi
bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi pembacaan dilakukan 3 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 6 baris sumuran. Sebagai
kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 , sedangkan untuk faktor koreksi,
100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37
o
C, dalam inkubator dengan aliran 5 CO
2
. Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10
μl MTT 2,5
μgml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37
o
C, dalam inkubator dengan aliran CO
2
5. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100
μl reagen stopper
pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya
serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. b. Sel Vero. Uji sitotoksisitas fraksi protein umbi rumput teki pada sel Vero
